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自噬（autophagy）相信大家都不陌生了，从2005年开始，关于自噬的研究越来越多，涉及的疾病和领域也越来越多。这两年虽然热度不及之前，但国自然自噬相关研究的中标数量还是呈增长趋势的。毫不夸张的说，只要标书写了自噬，中标的概率就增加了几分，只要你的信号通路拉上了自噬，文章就可以再往上攀一攀。 当时小优就很羡慕隔壁实验室的，做自噬做的滚瓜烂熟，文章拿到手软，一篇autophagy（杂志）可以让你奖学金拉满。下面这个前辈也是凭借阐述细胞自噬的机制拿到了诺贝尔“奖学金”。  在2016年，自噬相关研究被授予了诺贝尔生理医学奖 小优忍无可忍拿着笔记本就冲到老板办公室开门见山： “我要做自噬” 老板苦口婆心的说到“做氧化应激好不好” “我要做自噬” “再加个炎症” “我要做自噬” “你做自噬，你早就延毕啦” 没办法，只能背着老板偷偷做了。 小优先去查查资料，什么叫自噬。自噬是一种常见的细胞程序性死亡，是自噬溶酶体降解大部分胞浆内容物的一种分解代谢，实现资源回收利用的过程，自噬的异常与肿瘤，神经退行性疾病，代谢，免疫疾病等密切相关。 那么，怎么做自噬呢？小优看到自噬的信号通路已经晕了，简单一句话概括来说，就是很复杂。  自噬信号通路 师兄说：自噬的核心蛋白是LC3 这时隔壁热心的师兄告诉小优，想要观察自噬有没有参与，最简单的就是做下LC3的WB。WB这个小优可擅长了，三下五除二，就借（骗）到了隔壁实验室的LC3抗体。 还是先查查LC3再做吧，LC3是一种蛋白轻链3，是自噬过程的标志物。它的功能主要参与了自噬小体的形成， LC3前体分子被ATG4B剪去C端的5肽，裂解形成胞质形式LC3-I。然后被APG7L / ATG7激活，转移至ATG3并偶联脂酰乙醇胺（PE）以形成膜结合形式LC3-II它可以附着到自噬体(autophagosome)的膜上，是自噬体的结构蛋白。怪不得文献中涉及自噬的都会做LC3-I和LC3-II。  另外，LC3也在线粒体自噬中也发挥作用，通过消除线粒体至基本水平来满足细胞能量需求并防止过量的ROS产生，从而调节线粒体的数量和质量。线粒体的自噬主要是通过PINK启动的，PINK 蛋白在健康状态下通过 PARL 的作用持续降解，而在线粒体损伤时, PARL受到抑制，PINK 稳定并招募 E3 连接酶 Parkin，以启动自噬。 师兄说：样本表达是成功最大因素 好啦，了解的差不多了，可以动手做了。这时隔壁热心的师兄又提醒我，你这个样本表达怎么样啊？对哦，完全忘了这茬事了。如果我做的样本不表达或者表达很低，我也做不出来呀。 没办法，再去查查资料。在哺乳动物中，存在 4 种LC3 同工型（LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C），在不同的组织细胞中表达会有差异。目前主要研究的是LC3A和LC3B，LC3C在许多细胞中表达量很低，研究的也较少。LC3A主要在大脑中表达，其他组织的表达较低。LC3B在脑、内分泌组织等有较高的表达，在肝脏、结肠、心肌、脾脏等基本不表达。LC3B2许多组织中都有较高的表达，在骨骼肌中基本不表达。    表中数据来自human protein Atlas 这次是真的可以了，该查的都查了，可以开始做了。从制样，跑胶电泳，转膜，孵育，显色，一路顺风顺水，但结果总是当头一棒，目的位置啥条带都没，看着那清晰有力的actin，小优的头很大。  师兄说：要注意电泳转膜的条件 没办法，只能再去求助隔壁的师兄。师兄说LC3分子量比较小，只有16KD，在电泳的时候需要使用12%-15%的胶，避免跑过。转膜的时候需要使用0.22um的膜，缩短转膜的时间，40min即可。切莫使用0.45um的膜，否则量相对少的LC3I更不容易显出来。 经过师兄的指导，小优终于做出了条带。咦，我这个为什么是一条带？别人文献中明明都是两条带的，而且可以统计自噬的水平，我这个怎么办呢？  师兄不厌其烦的给我解释到：在自噬过程中，LC3-I逐渐转变为脂质化的LC3-II，当自噬的程度比较高时，LC3-I的量是较低的。当LC3-I和LC3-II总量恒定时，LC3-II/LC3-I用来表示自噬的水平。其次，与LC3-II相比，LC3-I对反复冻融更加敏感，更容易降解，因此一般需要用新鲜制备样品上样。这点倒是有可能，之前制好的样本经过几次优化和反复冻融，有可能造成LC3-I检测不到。 师兄说：选择合适的一抗也很重要 师兄说完转身从抽屉拿出了一本厚厚的本子，封面的字已经看不清了，隐约有一个“抗”字。翻到其中一页，给我讲到：目前的LC3抗体所检测的抗原表位都位于LC3的N端，由于PE基团结合可能导致N端区域的构象变化，使得抗体对LC3-II的亲和性更高。以CST抗体为例，LC3B的货号有单克隆抗体# 3868和多克隆抗体#2775。3868特异性高，2775灵敏度高，2775更容易识别LC3-I。 师兄又抽出夹在本子中的一张卡片给我看：  当时小优的表情是这样的  后来，小优独自摸索条件，经过几个月时间，终于做出了LC3B-I（啥，看不见，拿放大镜就能看见条带了）。  但是又有一个问题，这个结果表明自噬参与了吗？师兄说一般LC3-II条带深可以表明自噬程度高，可以通过扫描条带的灰度，计算LC3-II/LC3-I表示自噬的水平。有时因为LC3-I条带较浅，LC3-II/LC3-I的比值存在较大的误差，因此也有科学家用LC3-II与内参的比值进行半定量，综合考察。 师兄说：自噬参与程度看组间差异 最后师兄又给了我一个灵魂打击，你这个对照组和实验组都一样，说明自噬不是关键因素呀。 在这里，小优以血的经历告诉大家，没事别碰自噬。哦不，做之前一定要多查查自己样本的表达情况和自噬情况。如果不确定的话，可以简单做一个阳性对照，用氯喹过夜处理 (50uM) Hela细胞，这样可以帮助大家判断到底是什么问题导致WB或者荧光不出结果。这时，我才明白老板的用心良苦啊。 师兄说：别想念哥，哥只是个传说 很多小伙伴问我这么优秀的师兄去哪了，据说毕业去了优宁维做技术支持，在小优心里又高大了几分。 |
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