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对于微生物实验室而言，尽管NGS在速度、准确性和信息深度方面具备显著优势，但文库制备仍成为高通量实验室的瓶颈（图1）。为了应对这一挑战，Illumina与PerkinElmer携手合作，为宏基因组学提供了Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程。这是一个全面的NGS解决方案，支持从DNA提取到DNA分析的全自动化工作流程（图2）。与手动制备样品相比，在液体处理系统上制备Illumina DNAPrep文库具有显著优势。主要优势包括通量更高，可扩展性更强，减少人为操作和人为错误，工作流程一致性增强，以及提高速度。 用于宏基因组学的Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程包括使用chemagic 360仪器（PerkinElmer）和chemagic DNA Stool Kit Special（PerkinElmer）从粪便样本中自动提取DNA。提取DNA后， 在Sciclone G3 NGSx液体处理工作站（PerkinElmer） 上使用Illumina DNA Prep Library Preparation Kit（Illumina） 制备文库。Illumina DNA Prep Library Prep Kit 具有创新的磁珠固化转座酶（onbead tagmentation）技术，支持从各种生物体和样本中快速简便地制备文库3。该试剂盒可兼容广泛的DNA起始量范围（100–500 ng），无需对初始DNA样本进行准确定量，节省了文库起始量均一化所需的时间和成本3。 从DNA 提取到最终文库混合池定量，用于宏基因组学的自动化Illumina DNA Prep文库制备工作流程可在不到6小时的时间内，提供多达96个可以进行测序的宏基因组文库。此应用白皮书使用4名受试者的粪便样本，以比较Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程与标准手动工作流程用于宏基因组学分析的性能。  图1：高通量宏基因组学——宏基因组学实验室对复杂样本分析整个微生物群落，鉴定新物种，探索微生物群落与人类健康之间的联系。高通量宏基因组学实验室每周可能处理数百个样本，必须认真解决测序操作中的瓶颈问题。  粪便收集 从4位捐赠者处采集粪便样本，其中两名是按西方饮食习惯的成年人，两名是素食主义的儿童（双胞胎）。在分离DNA之前，将粪便样本在4℃下储存20小时。  储存温度、时间、稳定缓冲液的存在与否以及储存管的选择等因素都会对DNA 完整性产生重大影响。在本研究中，根据制造商方案，Illumina 将粪便样本储存在Omega StableGUT Collection Device Tube（ 货号AC7005，OmegaBio-Tek，Inc.）中，储存温度为4℃。  图2：用于宏基因组学的Illumina DNA Prep 文库制备自动化工作流程——Illumina 和PerkinElmer 已经携手合作，为高通量宏基因组学创建了一个全面的自动化NGS 文库制备工作流程。 DNA 提取 使用chemagic DNA Stool Kit Special（货号CMG-1076，PerkinElmer），在chemagic 360 仪器上进行提取（货号2024-0020，PerkinElmer）4。每次分离均采用150μL洗脱液，其产生的纯化DNA总量为300ng–3μg。对提取方法进行优化后，30 μL可产生的DNA 总量不小于100ng，这也是Illumina DNA Prep Library Prep Kit的最大起始量。使用LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer（ 货号CLS137031，PerkinElmer）5、HT DNA NGS 3K Reagent Kit（ 货号CLS960013，PerkinElmer）和Genomic DNA R eagent Kit（货号CLS760685，PerkinElmer）评估提取的DNA的完整性。采用chemagic方法可以从革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌物种实现DNA的理想分离。 自动化和手动文库制备 采用Sciclone G3 NGSx液体处理工作站（货号CLS145321，PerkinElmer）6和Illumina DNA Prep Library Prep Kit（货号20018705，Illumina），通过两次独立的自动化运行制备了90 个Illumina DNAPrep文库。总DNA起始量范围（100–600ng）与Illumina DNA Prep文库的推荐DNA 起始量范围（100–500ng）存在重叠。对于自动化的文库制备，使用固定体积的30μL chemagic纯化DNA，确保每个文库的DNA 起始量不小于100ng。为了比较Sciclone G3 NGSx 脚本与Illumina DNA Prep手动方案的性能，根据标准方案手动制备了相同DNA分离物的42个文库的子集。 测序 为了生成足够的基因组覆盖度以深入宏基因组学分析，按体积混合了48个Illumina DNA Prep文库（每个5μL）。采用HT DNA NGS 3KReagent Kit，通过LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer评估了混合文库，并使用DNA荧光计测量产量。采用NovaSeq 6000 S2Reagent Kit（货号20012860，Illumina），在NovaSeq™ 6000测序系统（货号20012850）上对文库进行测序，运行配置为2×150bp。 数据分析 标签表达图是在Illumina基因组学计算平台BaseSpace™ Sequence Hub中生成的。采用CosmosID Metagenomics7和Kraken Metagenomics8应用程序编译宏基因组分析堆积条形图，所用的测序数据集调整至300 万条reads，最多可达8000万条reads。可以通过BaseSpaceSequence Hub免费获取CosmosID Metagenomics和Kraken Metagenomics应用程序（图3）。采用MEGAHIT v1.1.1.9和QUAST v4.410评估基因组从头组装的质量，所用的数据集调整至40和60条双端read。  图3：BaseSpace Sequence Hub的宏基因组学应用程序——BaseSpace Sequence Hub提供了许多宏基因组学分析应用程序，包括CosmosID、Kraken、Prokka、QIIME等。  图4：采用自动化工作流程制备的8个文库的插入片段尺寸分布——Illumina DNA Prep工作流程可提供高度均一的插入片段尺寸分布，从而实现更均一的基因组覆盖度和数据准确性。该图显示了LabChip GX Touch Nucleic AcidAnalyzer 的8 个曲线图的叠加，代表了使用Illumina DNA Prep 文库制备自动化工作流程制备的8个不同文库。  图5：利用自动化工作流程对不同量的提取DNA 制备的文库的标签表达——Illumina DNA Prep工作流程针对广泛的DNA起始量产生一致且均一的标签 表达。用提取DNA的7种不同起始量制备文库，按体积进行混合，一式三份进行测序。  自动化文库制备提供了均一的 插入片段大小分布和标签表达 Illumina DNA Prep技术的主要优势之一在于能够使用广泛的DNA起始量范围，同时可以保持一致且均一的插入片段大小和文库产量。插入片段大小分布和文库产量均一性的提高，可以确保更均一的基因组覆盖度和数据准确性。为了评估插入片段大小分布，使用LabChipGX Touch Nucleic Acid Analyzer分析了采用Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程制备的8个文库。这些文库代表供体1（成人）的两个DNA分离物重复样本，以及供体3（儿童）的两个DNA分离物重复样本。每个DNA分离物产生两个重复的测序文库，总共产生8个文库。8条LabChip曲线叠加，显示了高度均一的插入片段尺寸（图4）。 为了进一步评估自动化Illumina DNA Prep工作流程的一致性，使用提取DNA的7种不同起始量（一式三份）制备了一系列文库。为了评估自动化文库制备法的产量，绘制了21个文库的序列池中每个文库识别的read百分比（通过过滤）（图5）。标签表达的高度均一性表明文库产量的均一性，也表明每个文库在流动槽上呈现均匀表达。即使提取DNA起始量范围大，自动化Illumina DNA Prep文库制备工作流程制备的文库仍具有高度均一的标签表达。 自动化和手动Illumina DNA Prep方案产生的宏基因组分析结果相当 为了评估自动化和手动制备的Illumina DNA Prep 文库在宏基因组分析方面的性能，对手动制备的文库和自动化制备的文库进行了测序并使用Kraken 和CosmosID Metagenomics应用程序进行了分析（图6和图7）。使用自动化Illumina DNA Prep 文库制备工作流制备的文库与手动制备的文库显示出相同的细菌门类和物种分布。此外，自动化工作流程能够识别供体1样本中的100多种物种（图8）。  图6：自动化和手动制备文库门类分布的比较——使用Kraken Metagenomics应用程序将自动化测序文库与手动制备文库进行对比分析，结果显示具有高度一致的细菌门类鉴定和分布。从供体1样本中生成的重复文库。  图7：自动化和手动制备文库物种分布的比较——使用CosmosID Metagenomics应用程序将自动化测序文库与手动制备文库进行对比分析，结果显示具有高度一致的细菌物种鉴定和分布。  图8：自动化文库产生丰富的宏基因组图谱——使用自动化Illumina DNA Prep文库制备工作流程从供体2（成人）样本制备文库。使用CosmosID Metagenomics应用程序通过4000万条read 组装相对丰度饼状图并识别100 多个物种（在识别的100多个物种里，图例中只包含26种）。 图9：使用基因组组装对手动制备和自动化制备的文库进行对比——采用6000万条read通过QUAST 对12个微生物进行基因组从头组装。使用自动化和手动方案，从供体1 样本中制备文库，一式三份。 自动化和手动Illumina DNA Prep 方案产生高质量宏基因组组装，结果相当 使用自动化和手动制备文库的相同数据集，使用QUAST计算组装的基因组分数百分比。通常，组装的基因组分数越高，说明基因组组装的质量越好。然而，组装基因组的百分比还取决于样本中特定物种的基因组与可用参考基因组之间的相似程度。在某些情况下，可用的参考基因组可能不完全匹配。在本研究中，针对分析的12种生物体，自动化和手动制备的文库所产生的基因组组装结果几乎完全相同（图8）。 Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程是高通量宏基因组学实验室可用的出色解决方案。在不到6 小时的时间内，自动化工作流程可以使用chemagic 360仪器（PerkinElmer）开展多达96 次DNA提取，使用Sciclone G3 NGSx工作站（PerkinElmer）和Illumina DNAPrep Library Prep Kit（Illumina）可以制备多达96个文库。自动化工作流程可生成高度均一的文库，并为复杂微生物混合物（即使是具有挑战性的粪便样本）的物种鉴定和宏基因组学分析提供良好数据。Illumina DNA Prep文库制备自动化工作流程具有显著优势，包括更高的文库一致性、更少的手动操作步骤和更大的可扩展性，是实验室扩大运营规模以及利用新一代测序的理想文库制备解决方案。 点击阅读原文了解Illumina DNA Prep Library Prep Kit 的更多信息。 参考文献
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来自： 刘得光3p6n6zqq > 《《因美纳》-20211224》
