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作为调查蛋白质在细胞内是如何工作的方法，将荧光蛋白质融合到目标蛋白质中来观察其荧光的方法被广泛应用。 迄今为止开发了各种颜色的荧光蛋白质。 其中波长最长的是近红外荧光蛋白iRFP。 长波带的荧光蛋白质不仅可以利用于与其他波长的荧光蛋白质的同时多色成像，而且长波带的激发光和荧光具有生物体深部透射性优良等优点。 但是，iRFP与其他荧光蛋白质不同，为了发出荧光需要一种叫做胆红素的色素。 因此，存在无法通过代谢合成胆红素的细胞种类不能利用使用iRFP的荧光成像的问题。 这次，基础生物学研究所定量生物学研究部门/生命创建探究中心定量生物学研究组的酒井启一郎研究生、后藤祐平助教、近藤洋平助教、青木一洋教授等人通过与东京大学的神谷真子副教授小组的共同研究，不仅发现了作为iRFP发色团至今为人所知的胆红素， 另外发现，与胆红素相比，使用岩藻蓝蛋白会使iRFP的荧光更明亮。 并且，在不能通过代谢合成胆红素和菲青霉菌素的分裂酵母细胞中，通过表达这些色素的合成酶也成功地增强了iRFP的荧光强度。 该成果于2021年12月16日发表在英国学术杂志《小区日报》上。 【研究背景】 将细胞内工作的蛋白质可视化的技术已经成为当今生命科学中不可缺少的技术。 从2008年获得诺奖的下村脩老师从水母中发现的绿色荧光蛋白质( Green Fluorescence Protein，GFP )开始，各种荧光蛋白质到现在为止都被开发出来了。 通过将荧光蛋白质与目标蛋白质融合，可以用荧光观察该蛋白质在细胞内是如何工作的。 通过组合具有不同荧光波长特性的多种荧光蛋白质，使多种蛋白质同时可视化的多重荧光成像近年来也成为了重要的技术。 荧光蛋白质中具有最长波长荧光特性的近红外荧光蛋白质iRFP是与其他颜色的荧光蛋白质组合的多重荧光成像和利用近红外光生物深部透射性的生物体内( in vivo )成像等所必需的荧光蛋白质。 一般的荧光蛋白质，如GFP，可以在蛋白质内部自发地制造接受光和发出荧光的结构，称为发色团，因此只有在细胞中表达GFP才能发出荧光(图1A )。 但是，iRFP与GFP等荧光蛋白质不同，会加入一种叫做胆红素的化合物作为发色团(图1B )。 胆红素是许多生物种类通过代谢合成的，但其持有量是否足够iRFP荧光取决于生物种类和细胞种类。 另外，不能通过代谢合成胆红素的生物和细胞，从原理上来说，不能将iRFP作为荧光蛋白质来利用。 研究小组为了将分裂酵母这一简单的单细胞真核模型生物的生命现象可视化，发现iRFP偶然无法观察到iRFP的荧光，为了了解为什么分裂酵母细胞内iRFP不发光，怎么才能发光，开始了这个研究。
【研究成果】 本研究小组偶然发现，单细胞真核模型生物之一的分裂酵母中，iRFP完全不发出荧光(图2A左)。 从外面向这个分裂酵母细胞中添加胆红素时，观察到了iRFP的荧光。 由此可知，由于分裂酵母的细胞内没有合成胆红素，因此iRFP不发出荧光(图2A右)。 考虑到酵母是否不具有合成胆红素的基因，我们搜索了基因组信息，调查了是否存在合成胆红素所需的血红素加氧酶( Heme Oxygenase，HO )基因。 结果，如所料，在分裂酵母中未发现该基因(图2B )。 有趣的是，我们发现HO基因在分裂酵母所属的菌类中零星丢失。
图2 .分裂酵母不能合成胆红素，所以iRFP不发出荧光。 ( a )即使分裂酵母中表达iRFP，也不能观察到荧光(左)，但从外部加入胆红素后就能观察到荧光了(右)。 ( b )合成胆红素的酶( HO )的基因在真菌类中零星丢失。 在将胆红素加入分裂酵母细胞的实验过程中，偶然发现加入胆红素的类似物菲青霉菌素会增强iRFP的荧光亮度(图3 )。 岩藻聚糖是蓝藻等藻类合成的光合色素的一种。 岩藻聚糖酶将胆红素合成为材料，与光接受蛋白质结合，具有吸收和传递太阳能的作用。 向分裂酵母中添加精制的岩藻聚糖酶后，与添加胆红素时相比，iRFP的荧光强度有所增强。 通过使用重组蛋白质的试管内( in vitro )实验发现，这种荧光的增强是由于iRFP自身亮度的增加、岩藻聚糖容易渗透细胞、荧光波长的变化而引起的。
 图3 .在分裂酵母中，岩藻蓝蛋白比胆红素更能提高iRFP的荧光亮度。 为了更便于利用使用岩藻朊蛋白的iRFP的荧光成像，引进了可以在细胞内人工合成岩藻朊蛋白的系统。 研究小组以前为了使用植物色素的光遗传学技术，开发了通过基因导入在哺乳类细胞中合成植物纤维蛋白的系统“syn PCB”( uda，ACS Chem Biol，2020 )。 因此，我们尝试将SynPCB导入分裂酵母，结果发现，如期待的那样在分裂酵母内合成了岩藻蓝蛋白，其结果稳定地观察到了高亮度的iRFP荧光(图4 )。  图4. SynPCB系统无需从外部添加发色团，即可提高iRFP的荧光亮度。 利用基于SynPCB系统的岩藻蓝蛋白细胞内合成，利用iRFP和其他4种荧光蛋白质，在活的分裂酵母细胞中同时可视化了5种蛋白质的定位(图5 )。 迄今为止，分裂酵母的多重荧光成像极限为3~4色，但此次成功实现了iRFP的高亮度化，扩大了多重荧光成像的选择范围。
【发表杂志】 杂志名称《小区科学杂志》刊登日2021年12月16日 论文标题 Near-infrared imaging in fission yeast using a genetically encoded phycocyanobilin biosynthesis system 作者:： Keiichiro Sakai, Yohei Kondo, Hiroyoshi Fujioka, Mako Kamiya, Kazuhiro Aoki, and Yuhei Goto DOI： https:///10.1242/jcs.259315 【研究小组】 本研究是由基础生物学研究所/生命创建探究中心的青木一洋教授等、东京大学药学部神谷真子副教授等组成的共同研究小组的成果。 【研究支持】 本研究在科学技术振兴机构CREST(JPMJCR1654 )和文部科学省日本学术振兴会科学研究费资助事业( 18H02444、19H05798、19K16050 )的支持下进行。 【有关本研究的咨询方式】 基础生物学研究所定量生物学研究部门 生命创成探索中心定量生物学研究小组 教授青木一洋 0564-59-5235 电子邮件: k-Aoki @ Nibb.AC.JP 【新闻负责人】 基础生物学研究所宣传室 0564-55-7628 传真: 0564-55-7597 电子邮件: press @ Nibb.AC.JP 自然科学研究机构生命创建探究中心研究合作推进室 0564-59-5201 传真: 0564-59-5202 电子邮件: press @ excells.Orion.AC.JP |
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