 嘻嘻嘻~你们的小阔爱来啦~ 一日不见如隔三秋，何况你的小阔爱还是一枚优秀的技术支持~ 每次都带来惊喜~嗷~ 本期带来二代测序平台对比介绍~ 前言 随着人类基因组计划的完成，测序技术的不断发展成熟，二代测序[也称下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）] 越来越广泛应用于医学领域。NGS测序平台经历了一系列收购合并，目前测序平台主要来源于三家公司： Illumina、Life Technologies和华大基因。所谓“工欲善其事，必先利其器”，想要做好肿瘤基因测序，必须先要“pick”好二代测序平台！本文将围绕上述三大主要的平台展开对比介绍，让我们一起了解一下到底谁家测序平台更适合您~ Illumina 1.1 基本原理 核心原理：边合成边测序（Sequencing By Synthesis，SBS）。主要流程：以双端测序为例，主要包括DNA文库构建、流动槽（FlowCell）吸附、桥式PCR、SBS和数据分析过程。 1.2 主要测序仪 Illumina二代测序平台的核心原理为SBS。目前常用的测序仪有如下3款。 图1-1 Illumina MiSeqDx[1] MiSeqDx：是第一台经FDA批准、适用于体外诊断（IVD）检测的NGS平台，并于2018年7月30日获得NMPA认证。 适用范围：专为临床实验室设计，适用于靶向基因测序、靶向基因表达谱、小型全基因组测序、16S宏基因组、长片段扩增子测序等。并广泛应用于癌症、液体活检等医学领域[1][2]。 仪器特点：MiSeqDx的操作简便、体积小；灵活性强（不同通量的试剂可选，通量300MB~15GB）；可双末端测序。但由于通量受限，MiSeqDx不适合用于全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）和全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）[1][2]。 Illumina NextSeq 500 NextSeq 500：是Illumina在2014年发布的一款高通量台式测序仪，其测序原理为改良的双通道边合成边测序（双通道SBS）技术。 适用范围：靶向序列测序、大/小型全基因组测序、外显子组测序、全转录组测序、基因表达谱、甲基化测序和16S宏基因组测序等。NextSeq 500同样适合用于癌症、液体活检等科研实验[1][2]。 仪器特点：NextSeq芯片通量更加灵活（16.25GB~120GB），可根据数据量需求，选择合适通量的芯片。并且双通道SBS技术减少测序所需时间[1][2]。 Illumina MiniSeq 图1-3 Illumina MiniSeq[1] MiniSeq：是Illumina于2016年1月发布小型台式测序仪，其体积比MiSeq小。该系统采用改良的双通道边合成边测序技术原理。 适用范围：靶向基因测序、靶向基因表达谱、小型基因全基因组测序、长片段扩增子测序、16S宏基因组测序等，可用于癌症、液体活检等科研实验[1][2]。 仪器特点：运行时间短（7~24h）；操作简便且通量灵活性高（1.65GB~7.5GB），对于通量小医疗单位，不需要累积大量样本再上机；但MiniSeq不适合WGS和WES。 1.3 技术特点 技术优点： 1. 通量灵活。 2. 简单、快速、自动化，减少手工操作引入的误差及污染。 3. 利用可逆荧光标记终止子，可在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入，并减少掺入的误差；同时SBS确保了高质量数据。 4. SBS策略解决由于相同碱基聚合导致测序不准确问题。 5. 错误率可低至0.1%，主要错误来源是碱基替换。 6. 可采用双端测序技术。 技术缺点： 1. 测序读长短（目前二代测序平台面临的共同难题）。 Life Technologies 2.1 基本原理 Ion Torrent测序同样采用SBS策略，与Illumina不同的是，其应用半导体测序技术，主要基于当dNTP结合时将释放氢离子（H+）引发pH变化来获取碱基信息进行测序。主要步骤包括文库构建、乳液PCR、微珠富集、测序反应和数据分析。 2.2 主要测序仪 Life Technologies测序的核心技术是利用半导体技术将化学信号转化为电信号，从而实现实时碱基判读。Life Technologies于2013年被Thermo Fisher Scientific收购，目前常用的测序仪有如下几款。 Ion Proton System 图2-1 Ion Proton[3] Ion Proton：是Life Technologies于2012年在中国推出的新台式基因测序仪。其核心技术为离子半导体测序技术。 适用范围：人类基因组、外显子组或转录组测序[2][3]。 仪器特点：与Illumina和华大基因的测序平台不一样，Life Technologies的平台无光学系统，其使用半导体测序技术，因此运行速度快（2~4h）。 Ion S5和 Ion S5 XL 图2-2 Ion S5和Ion S5 XL 系统[3] 注：A: Ion S5, B Ion S5 XL. Ion S5和Ion S5 XL：是Thermo Fisher于2015年发布的两款适用于靶向测序的二代测序仪。Ion S5 XL与Ion S5相比，增加了本地运算，提升了数据分析速度。 适用范围：适用于靶向RNA和DNA测序、微生物、转录组、外显子组成。可用于癌症、遗传病等科研实验领域[2][3]。 仪器特点：运行速度快（2.5~4h）。与Ion Proton的单端读长（Single-end，SE）200bp相比，读长更长，可达SE400bp。 2.3 技术特点 技术优点： 1. 速度快，周期短。 2. 芯片通量灵活（0.3~0.5GB至10~15GB）。 技术缺点： 1. 只能做单端测序，单端测序最长读长400bp。 2. 其技术原理导致测量单个碱基多次重复（如GGGGGG）可能出现误差，这是限制该测序技术发展的主要原因[4]。 华大基因 3.1 基本原理 核心原理：边连接边测序（Sequencing By Ligation，SBL）。华大基因二代测序平台（以BGISEQ-500为例）的五大关键技术流程：文库构建、DNA纳米球（DNB）纳米阵列组装、联合探针锚定聚合技术（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL）、多重置换扩增的双末端（Multiple Displacement Amplification-Pair End，MDA-PE）测序法和数据分析。 3.2 主要测序仪 华大基因的BGISEQ-1000虽然是国内首个通过注册的第二代基因检测平台，但BGISEQ-1000是一个大型平台且难以小型化，对环境要求极苛刻，并不普遍适用于一般小型科研机构或医院。因此华大基因在2015和2016分别推出BGISEQ-500和BGISEQ-50，是目前常用的测序仪。 BGISEQ-500 图3-1 BGISEQ-500 [5] BGISEQ-500：是华大基因于2015年推出的新型桌面化测序系统，以cPAL及改进的DNB为核心技术支撑。 适用范围：靶向基因测序、肿瘤全外显子组测序、转录组测序等[2][5]。 仪器特点：配备双芯片平台（单芯片65~260GB/run；双芯片130~520GB/run）；但其最长读长只有 双端100bp（Paired-end，PE）。 BGISEQ-50 BGISEQ-50：华大基因于2016年推出的自主研发高通量台式测序系统，其延用BGISEQ-500的核心技术原理。 适用范围：无创产前筛查NIPS、植入前胚胎染色体筛查PGS、未知病原体快速检测 PM-Seq、染色体异常检测 ChromoSeq[5]。 仪器特点：与BGISEQ-500相比，BGISEQ-50更小巧、环境适应性更好,平均数据量更小（5.6~8GB/run）,解决了BGISEQ-500在样本量少时浪费芯片空间的问题。但BGISEQ-50读长更短（SE50bp），不利于数据分析。 3.3 技术特点 技术优点： DNB测序技术降低了试剂耗费同时增加数据产出，提高测序准确性。具有如下优势： 1. 增加待测DNA拷贝，增强信号强度，从而提高准确性。 2. 滚环扩增中扩增错误不会累积。 3. 芯片上每个活化位点只固定一个DNB，保证信号间不会相互干扰。 4. 阵列化测序芯片结合DNB测序技术使成像系统像素和测序芯片面积得到最大利用。 技术缺点： 1. 华大基因的二代测序平台的读长是三大平台里面最短的，基因拼接可操作性差，这对数据分析影响大。 总结 如此看来，这三大二代测序平台各有优势，先做一个简单的对比总结（表4-1）：  首先是Illumina：目前Illumina已在第二代测序市场中占主导地位[6]。无可否认，由于其技术成熟，平台稳定多样且平台之间具有高度互补性与交叉性，使其在高通量测序市场上占很大优势。因此也越来越多研究实验选择使用Illumina的NGS平台[7]。缺点则是平均测序成本相对其他两个平台更高点。 然后是Life Technologies的测序平台，其最具特色的是它们的技术原理——半导体测序技术。Ion Torrent是首个无需光学传感系统的NGS平台[8]，其将化学信号转化电信号，即通过合成碱基时释放出的H+实现碱基的实时判读，提升了测序速度。不过其对连续碱基的检测还不够完善，且测序准确率较Illumina还是有所不及。 最后介绍的是华大基因。数据量大、平均测序成本低是其优势，适合做大型全基因组测序。但是要考虑样本量有限时，芯片数据量浪费的情况。除此以外，华大NGS平台的读长较短（BGISEQ-500最长读长PE100bp；BGISEQ-50最长读长SE50bp），基因拼接可操作性较差，这影响了后续数据分析。 如此分析下来，Illumina在二代测序市场中能一马当先就理所当然了。但想要“pick”好适合自己的平台最后还是要结合具体情况具体分析~ 参考文献 |
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来自： 刘得光3p6n6zqq > 《燃石医学》
