影响 PCR 体系蒸发的三大因素在这里，戳！

提及 PCR 实验，是否出现过这样的问题？

假阳性

非特异性扩增

数据重复性差

假阴性

拖尾

无扩增产物

样本降解

其实，造成这些结果的原因有很多，例如引物质量不佳、模板质量不好、退火温度不合适等，但还有一个不容忽视的问题——PCR 体系蒸发。

聚合酶链式反应（PCR）需要依赖 PCR 仪对各反应阶段的温度和加热时长进行控制，整个 PCR 反应通常需要经过 20～40 次加热、冷却的温度循环，这个过程带来的反应如试剂蒸发和损失，对许多 PCR 实验结果影响显著，在检测灵敏度高的 qPCR 实验中还影响透光性，从而导致结果不准确。

那么，影响 PCR 体系蒸发的因素都有哪些呢？

1、热盖压力、温度

为了防止 PCR 高温反应中试剂向上挥发，PCR 仪一般通过在试液孔板上方覆盖热盖单元，以上方高温来减少试剂的挥发。但热盖能完美解决蒸发问题吗？

PCR 仪的热盖大致可以分为以下四种：非可调式热盖、可调节式热盖、自适应式热盖和自动式热盖。而「可调节式热盖」利用手拧压紧式，拧不紧会发生试剂蒸发，一些厂家通过增加热盖压力以减少边缘蒸发，但该方法并不能完全消除这一现象，有时拧得过紧反而可能出现压坏管子、拧坏旋钮的情况，有的仪器甚至会因拧得过紧而导致试剂蒸发。也有一些厂家通过在热盖上增加软性导热材料来解决这一问题，但目前，软性导热材料的使用寿命无法明确。

通常，采用电动智能热盖，能够自动感应不同高度的耗材，自动压紧耗材，压力均匀且恒定，从而能够减少试剂蒸发和人工误差，提高实验准确度和可重复性。

2、耗材形变

尽管目前通过热盖技术大大防止了体系蒸发，但在反应溶液的总体积仅有 3～5 μL 的情况下，由蒸发带来的影响依然十分显著。

PCR 孔板通常为塑料材质，在受热后发生膨胀，产生较大地变形，用于放置 PCR 孔板的 PCR 金属基座则受热膨胀率极小，如图所示，PCR 孔板受热膨胀后不能正常沿平面延展进而中间形成拱起状态，从而造成上方热盖不能全面地与 PCR 孔板上表面充分接触，造成温度、压力不均，引起 PCR 孔板边缘试剂的蒸发，影响 PCR 检测效果。

3、耗材密封不严

热盖与耗材压紧并不等于盖紧了 PCR 管盖，PCR 孔板质量参差不齐，一些孔板的盖子本身密封不严，即使使劲盖，也没有用。同时，开关盖过程繁琐，有时还会造成漏液、气溶胶污染。

传统解决蒸发问题的办法：

1.放大反应体系：例如 10 μL 的体系改成 20 μL；

2.在试剂表面加石蜡油：添加石蜡油不仅增加实验步骤，还影响样品的下一步应用。

于是，方便易封、防蒸发的封膜仪和热封膜成为不二选择。

文章来源：丁香学术