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Nature communications 2020.06.12 IF:14.919 // Introduction Arenite resistance gene 2(ARS2)最早是在抗砷仓鼠细胞系中发现的，它含有多个核定位信号和一个锌指结构域。除了对亚砷酸盐的抗性有贡献外，ARS2还在哺乳动物发育、调节细胞增殖以及促进参与细胞转化和炎症的几个微小RNA(MiRNAs)的积累方面发挥着重要作用。最近的一项研究表明，ARS2与维持神经干细胞(NSCs)的自我更新特性密切相关，ARS2是通过直接诱导多潜能维持基因SOX214来控制多潜能NSCs的转录因子之一。然而，ARS2的作用从来没有在癌症的背景下被研究过，更不用说在一般的胶质瘤或GSCs中了。 单酰甘油脂肪酶(MAGL)由MGLL基因编码，是一种脂解酶，能将单酰甘油水解成甘油和游离脂肪酸(FFAs)15。MAGL在大脑和白色脂肪组织中高表达；然而，MAGL在侵袭性癌细胞中也高度表达，它通过产生FFAs15-17来调节癌症代谢。MAGL的另一个作用是将内源性大麻素2-花生四烯基甘油(2-AG)水解成花生四烯酸(AA)，花生四烯酸可以被酶促转化为前列腺素E2(PGE2)18，19。已有研究表明，用临床上可用的抑制剂对MAGL进行药理阻断，可以在大脑中发挥抗炎作用和神经保护作用。尽管有令人信服的临床证据支持MAGL的作用，但还没有研究表明MAGL与最致命的脑部疾病GBM，特别是GSCs之间的联系。此外，关于MAGL潜在调控因子的有趣问题仍然存在于分子和细胞水平。 // Results
 ARS2与低存活率和GSC干性相关。 为了研究ARS2与胶质瘤患者临床预后的关系，我们首先分析了Rbra(分子脑肿瘤数据库)中ARS2的表达谱，该数据库包括105例星形细胞瘤患者、181例GBM患者和336例各种类型的胶质瘤患者。与28例非肿瘤脑组织相比，胶质瘤患者的ARS2 mRNA表达显著上调(图1A)。在336例全脑胶质瘤患者中，ARS2高表达患者的生存期明显短于低表达患者(图1B)。值得注意的是，在181例GBM患者中也观察到了类似的显著关系(图1C)。与此一致的是，在TCGA(癌症基因组图谱)数据库中，ARS2的高表达预示着所有胶质瘤和GBM患者预后不良(图1D，E)。这些结果共同揭示了ARS2 mRNA的表达与高级别胶质瘤以及低患者存活率之间的重要关联。 为了了解脑胶质瘤患者ARS2的蛋白水平，我们分析了49例脑胶质瘤患者和5例韩国国家癌症中心(NCC)正常脑组织中ARS2的蛋白水平。ARS2蛋白在正常大脑中几乎检测不到，但在患者肿瘤样本中广泛而强烈地表达(图1F和补充图1A，b)。接下来，我们研究了ARS2的表达是否与胶质瘤的干样特性有关。免疫荧光分析表明，ARS2与NSCs的标志物Nestin在人GSC X01来源的小鼠异种移植样本中共表达(图1g，h)。此外，图1I显示了TCGA数据库中ARS2和Nestin表达之间的显著正相关。综上所述，这些结果表明ARS2mRNA和蛋白的上调与胶质瘤的恶性和GSC的自我更新密切相关。 ARS2调控GSCs的自我更新和致瘤性。 为了确定ARS2是否参与胶质瘤干性的调节，我们用两种不同的短发夹状RNA(ShRNA)选择性地下调了GSCs中ARS2的表达，并检测了球体形成能力和细胞增殖(图2A-F)。在GSC 528和X01细胞中，ARS2的特异性下调抑制了未分化细胞的标志Nestin的表达，同时上调了分化标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达(图2A，D)。在限制稀释试验中，ARS2的敲除显著降低了GSCs的球体形成能力，这是一种广泛使用的确定干细胞自我更新能力的方法(图2B，E)。ARS2的敲除也显著地阻止了GSCs的增殖(图2C，F)。相反，ARS2的过表达显著增加了GSCs的球体形成能力和增殖率(578和0502细胞)。 为了解决ARS2在体内的致瘤性，我们从X01对照细胞系及其ARS2基因敲除的衍生物中建立了小鼠异种移植模型，并比较了肿瘤质量和总存活率。来自荷瘤小鼠的脑切片苏木精-伊红(H&E)染色显示，与相应的亲本对照模型相比，ARS2基因敲除异种移植模型的肿瘤质量明显减少(图2G)。此外，两种ARS2基因敲除的异种移植物的总存活率均显著长于对照组小鼠(图2H)。总之，这些发现表明ARS2是GSC增殖所必需的，并且对于调节GSC的自我更新和胶质瘤的致瘤性是必不可少的。 MGLL作为ARS2新的靶基因的鉴定。 考虑到ARS2是一个广为人知的转录调控因子，参与了NSC茎的维持，我们在ARS2缺失后进行了RNA测序(RNA-Seq)转录组分析。每一个被确认为ARS2-敲除下调的基因都被仔细研究了它在癌症发病机制中的意义。参与家务活动或与癌症无关的基因被排除在外。在ARS2下调的最有希望的基因是MGLL，编码MAGL(图3A)。尽管有大量报告表明MAGL与侵袭性肿瘤有显著关联，但还没有研究将MAGL与胶质瘤联系起来。 为了建立MAGL和ARS2表达之间的联系，我们首先证实了MAGL mRNA和蛋白在ARS2过表达和下调的GSC中的表达。ARS2在GSCs中的过表达在mRNA和蛋白水平上上调了MAGL(图3B，c)。相反，减少GSCs中ARS2的表达会在mRNA和蛋白水平上下调MAGL的表达(图3D，e)。 通过染色质免疫沉淀(CHIP)分析，我们进一步研究了MGLL是否是ARS2的直接下游靶点。为此，我们设计了四对引物(1-4区)，覆盖了相对于−转录起始位点的MGL1300bp至 26bp区域(补充图3A)。如补充图3B所示，抗ARS2的抗体有效地免疫沉淀了mgl1基因上游与区域3(−1018至−887bp)和区域4(−1300至−1093bp)相对应的特定区域。通过定量聚合酶链式反应(QPCR)评估了ARS2在第3和第4区域的相对富集情况，发现引物集3和4扩增的区域的ARS2占有率分别是对照IgG免疫沉淀的5倍和25倍(图3F，g)。为了确认ARS2和MGLL之间的转录关系，我们使用基于慢病毒的报告系统来监测与上述上游启动子区相连的荧光素酶报告基因的表达，该报告基因包含ARS2的结合位点(图3H)。这些报告分析是在GSC X01细胞中进行的，无论是否有ARS2特异性shRNA表达慢病毒的混合感染。如图3H所示，X01细胞中的ARS2基因敲除显著降低了相对荧光素酶的表达，表明ARS2对MGLL的转录活性降低。综上所述，这些数据表明，一些基因可能受ARS2在转录水平上的调控，并特异性地将MGLL确定为GSCs中ARS2的新靶点，这与MAGL在侵袭性癌症中的作用一致。  MAGL在神经干细胞自我更新和致瘤性中的作用。 我们接着问MAGL本身是否调节GSCs的自我更新能力和致瘤性。MAGL过表达的GSC 578和0502细胞系球体形成显著增加(图4a-d)。相反，528和X01细胞中MAGL的缺失完全取消了球体形成能力(图4e-h)。此外，MAGL在528和X01细胞中的敲除诱导了星形细胞分化标记GFAP的表达，但降低了茎性标记Nestin的水平(补充图4A，b)。这些MAGL的功能损失和功能增益分析表明，调控MAGL表达对GSC自我更新的功能影响与调控ARS2表达的功能相似。为了研究ARS2调控的MAGL表达对GSC自我更新能力恢复的影响，我们在GSC X01细胞中敲除ARS2，然后过表达MAGL。ShRNA介导的ARS2基因敲除显著降低了自我更新(图4i，j)，而MAGL在GSC X01细胞中的过表达导致了最高程度的自我更新(图4i，j)。值得注意的是，在ARS2基因敲除的X01细胞中过表达MAGL恢复了自我更新能力，产生了与对照几乎相同的茎化程度(图4i，j)。
为了解决MAGL在体内的作用，我们在裸鼠体内原位注射对照X01细胞或两个不同MAGL基因敲除的X01细胞系。MAGL基因敲除的异种移植瘤体积缩小或不存在(补充图4C)。注射MAGL耗尽的X01细胞的异种移植小鼠比注射对照X01细胞的小鼠存活时间明显更长(图4K)。这些发现表明MAGL能够调节GSCs的特性，特别是自我更新和致瘤性。
MAGL通过PGE_2/pLRP6/β-catenin调控自我更新。 先前的研究表明，前列腺素E_2刺激β-连环蛋白的积聚和激活刺激白血病干细胞的干性、结肠癌细胞的生长和胶质瘤24-26的进展。因此，我们使用MAGL靶向shRNA(ShMAGL)选择性地下调了MAGL的表达，并随后评估了PGE2水平和β-catenin在GSC中的表达(图5A，b)。MAGL的敲除同时降低了GSC中PGE2的产生和β-catenin的积累(图5A，b)。由于β-catenin的表达与其在转录激活中的作用密切相关，我们确定了ARS2或MAGL是否影响β-catenin的表达。我们检测了ARS2/MAGL基因敲除后，分离的细胞核或胞浆裂解产物中β-catenin蛋白的水平。核蛋白和胞浆蛋白的分离成功，分别用拉米明B和β-肌动蛋白进行了验证。正如预期的那样，MAG1或ARS2在528和X01细胞中的敲除降低了细胞核中的β-catenin蛋白水平(图5c，d)。此外，PGE2以浓度依赖的方式增加β-catenin的表达，并与增强LRP6磷酸化有关(图5e)。PGE_2(补充图5H)也以浓度依赖的方式提高了GSC的球体形成能力，这一作用可被Tcf/β-catenin介导的转录的特异性抑制剂ICG-001(图5F，g)27所阻断。用ICG-001处理GSC528和X01细胞，通过下调Tcf/β-catenin介导的细胞周期素D1和c-Myc转录，显著降低GSC球体形成能力(图5H，I)。综上所述，这些发现有力地表明MAGL通过PGE_2/pLRP6/β-catenin信号调节GSC的自我更新。
ARS2/MAGL通过PGE2诱导TAMs类M2极化。 我们比较了脂多糖或白细胞介素(IL)−-4或前列腺素E_2对M1或M2巨噬细胞TAM极化的诱导程度。PGE2诱导M2样巨噬细胞标志物CD206(MRC1)、CD163和ARG1(精氨酸酶-1)的表达，其程度与IL4诱导的程度相当(图6A，b和补充图6C-e)。Krupple样因子4(KLF4)是调节M2样TAM基因31表达的关键转录因子，经IL4或PGE2处理后，KLF4的表达显著增加(图6A)。相反，用前列腺素E_2处理巨噬细胞减少了肿瘤坏死因子α和CD86的表达，这是M1样巨噬细胞的标志物(图6A，C)。
接下来，我们使用免疫荧光方法检测了GSCs中PGE2的ARS2和MAGL的表达状况(图6d-g)。在注射对照X01细胞的小鼠的免疫染色组织图像中，清晰地检测到PGE2(红色)。正如预期的那样，在注射ARS2基因敲除(图6d，e)或MAGL基因敲除(图6f，g)的GSCs的小鼠的组织中没有检测到PGE2。我们还通过标记表达对浸润性TAMs的M1和M2亚型进行了研究。在感染shARS2的GSC形成的GBM肿瘤中很少检测到M2样TAM表达标记CD206和ARG1，相反，这些肿瘤显示M1标记CD86上调(图6D，e)。在感染shMAGL(图6f，g)的GSCs中，也观察到CD86表达增加，CD206和ARG1表达降低，PGE2产生减少(图6f，g)。因此，我们的数据支持这样的结论，即ARS2或MAGL击倒会增加类M1的TAM极化。重要的是，在ARS2或MAGL基因敲除的GSCs形成的肿瘤组织中，茎标记Nestin的表达减少，分化标记GFAP的表达增加(图6d-g)。
// Conclusion 综上所述，我们发现ARS2是一个新的重要的转录因子，通过MAGL介导的信号转导促进GSCs的干细胞同一性，进一步表明阻断MAGL为治疗GBM提供了一条很有前途的治疗途径。 reference:ARS2/MAGL signaling in glioblastoma stem cells promotes self-renewal and M2-like polarization of tumor-associated macrophages PMID:32532977 DOI:10.1038/s41467-020-16789-2 |
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