|
1.1荧光染料和荧光探针 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。 探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。探针类由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但实时荧光定量 PCR则简便易行。 1.2SYBR GreenI工作原理 SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR GreenI的最大吸收波长约为497nm ，发射波长最大约为520nm。 在PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 1.3LUX 引物工作原理 LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。 1.4TaqMan探针工作原理 1.5分子信标（molecular beacon）工作原理 分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。 1.6荧光阈值(Threshold) Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
|
|
|
