 导语 今天给同学们分享一篇关于非肿瘤+单细胞联合bulk数据的生信文章 “ Expression of Immune Related Genes and Possible Regulatory Mechanisms in Alzheimer’s Disease ”，这篇文章于今年发表在 Frontiers in Immunology 杂志上，影响因子=7.561。本研究通过结合单细胞RNA（scRNA）和bulk-seq测序数据的生物信息学分析，研究了IRG在AD中的表达特征和可能的调控机制。 1.AD中PBMC的scRNA分析 分析了来自GEO数据库的scRNA测序数据集（GSE181279），其中包括36849个PBMC，包括来自AD患者的22775个细胞和来自对照组（NC）的14074个细胞。过滤后，保留了24679个细胞，包括来自AD患者的14033个细胞和来自NC的10646个细胞。每个样本的表达特征如图1A所示。nCount_RNA表示唯一分子标识符（UMI）的数量，与表示基因数量的nFeature_RNA正相关，相关系数为0.92（图1B）。确定了前10个HVG（图1C）。S100A8和S100A9是前两个HVG，它们是在炎症条件下高度表达的small calcium-binding proteins。PCA识别了所有15个P值<0.05的PC，如图1D所示（图1D），使用10个PC识别了8个集群，并列出了每个集群的前10个差异基因（图1E）。  图1 AD中PBMC的scRNA分析 根据之前的一项研究，这些集群可以通过标记基因分配给已知的细胞谱系。使用t-SNE分析可视化了八个聚类（图2A）。椭圆标记的NK集群显示AD组中NK集群的百分比降低（图2B）。细胞类型标记基因的表达显示在点阵图（图2C）和小提琴图（图2D）中。每个集群中细胞的数量和比例分别如图2E所示。与NC组相比，AD组的NK集群显着减少（5%对21%），而CD4 T细胞在AD组中显示出增加的趋势（图2F）。在随后的分析中，作者主要关注PBMCs的NK集群。  图2 每个集群的标记基因表达 2.AD中PBMC细胞集群的IRG评分 为了研究AD中PBMC的IRG表达特征，基于ImmPort数据库对各集群的EG进行筛选以生成IRG，该数据库总结了已发表研究的IRG，并从PBMC中每个集群的差异基因中获得了212个IRG。AUCell R包用于确定每个细胞系的IRG活性（图3A）。表达更多基因的细胞表现出更高的AUC值，这些细胞主要在NK和DC细胞中，颜色为黄色（图3B）。由于AD组中NK聚类显着减少（图2B，F），作者进一步对来自PMC的NK聚类中的差异基因进行了GO和KEGG分析。这些功能与富集通路主要与抗原处理和免疫应答有关（图3C，D）。  图3 AD中PBMC细胞集群的IRG评分 3.来自bulk seq测序数据的AD差异基因 为了研究AD中脑组织的表达特征，分析了包括310名AD患者和157名对照组的散装RNA测序数据集GSE33000，以探索AD大脑中的差异基因，并筛选PBMC和脑组织之间的常见IRG。调整后的 P 值< 0.05 的差异基因和 |logFC|>0.03。此后，在AD大脑中保留了5339个上调和5542个下调差异基因（图4A）。图中显示了top100上调和top100下调差异基因的热图，并且在组内观察到相对一致性（图4B）。有趣的是，与AD的PBMC中NK集群的表达特征类似，AD大脑中差异基因的前10个GO功能通路也集中在免疫反应上（图4C，D）。这些数据表明，AD PBMC中NK集群的差异基因与AD大脑中的差异基因具有相似的GO通路，这表明NK细胞在AD患者大脑中的潜在作用。  图4 来自GSE33000数据集的AD差异基因 4.常见IRG和相关监管转录因子 由于来自PBMC的NK集群中GO的差异基因和来自AD大脑的GO的差异基因主要集中在免疫反应上，作者进一步研究了NK cells与AD脑之间IRGs的共同表达特征。在PBMC NK集群和AD大脑中共发现了70个常见的IRG（图5A）。GSE33000中前40个常见IRG的表达主要活跃于来自PBMCs的NK集群（图5B）。 为了研究IRG的转录调控活性，从HumanTFDB（http://bioinfo.life.）获得了1665个TF的列表。保留了来自PBMC的AD NK集群中的34个TF和AD大脑中的765个TF。此外，此外，17种常见的TFs在AD周边NK集群和AD大脑中均表达（图5C）。FindAllMarkers 函数是使用默认参数应用的。在这种情况下，仅选择在超过25%的细胞中表达的阳性基因，logFC截止值为0.25。在所有集群中共鉴定出1979个独特的标记基因。对于NK集群，共鉴定出778个标记基因，仅34个基因属于TF。因此，周边NK标记基因、AD脑差异基因和TF数据库交集的TF仅为17个。显示了GSE33000和AD周边NK集群中17个TF的表达式（图5D，E）。13个TF在AD大脑中上调，所有17个TF在NK和NKT细胞中活跃。PPI网络表明，STAT3可能作为IRG转录调控中的中枢基因发挥关键作用（图5F）。  图5 常见的IRG和相关转录因子 5.确认NK在AD大脑的浸润情况 确认NK细胞浸润到大脑中。作者从GEO数据库中选择了scRNA测序数据集GSE142853，该数据库对来自3XTg-AD小鼠大脑的分选NK细胞进行了测序。共有3250个细胞，包括来自AD小鼠的1634个细胞和来自NC小鼠的1616个细胞。生成了十个集群（图6A）。AD组的聚类6百分比高于NC组（4.6%对2.9%）（图6B）。cytotoxic molecule (Cstd), pro-inflammatory chemokines (Ccl3, Ccl4), adhesion molecules (Icam1)和NK cell activation molecules (Tbx21, Nfatc1, Nfkbia, and Klra9) 在集群6中高度表达（图6C，D）。此外，使用SingleR和Celldex R包对这些聚类进行注释，并使用分数计算预测准确性。SingleR是一种用于scRNA测序数据的自动注释方法。SingleR提供具有已知细胞类型标签的样本的参考表达数据集，并且可以根据与参考的相似性来标记新细胞。celldex R包提供了一种简单的方法来应用SingleR包来注释scRNA测序数据。分数越高表示预测越准确，NK细胞被注释为最高分。结果表明，GSE142853的10个集群中有9个被注释为NK细胞，而一个集群被注释为小胶质细胞。NK和小胶质细胞注释都标记为黄色，表示更高的精度（图6E）。tSNE图显示3XTg-AD小鼠大脑中小胶质细胞和大多数NK细胞的比例非常小（图6F）。综上所述，GSE142853数据集证实了AD大脑中NK细胞的发生，一些浸润的循环NK细胞在AD大脑中被激活。  图6 AD脑中NK细胞的scRNA分析 小结 在这项研究中，作者提出外周NK细胞可能渗透到大脑中，并使用结合scRNA和bulk seq数据的生物信息学分析，探讨AD中的神经炎症变化。此外，STAT3可能参与IRG的转录调控，浸润和NK细胞的活化。 |
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