揭开基因测序的神秘面纱(二)：总结第一代基因测序技术

昵称32772025 2022-01-18

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▉ 写在前面

DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，由五碳糖、磷酸基团及含氮碱基构成。DNA由四种脱氧核糖核酸（A、T、C、G）组成的两条反向互补平行长链相互缠绕而成的双螺旋结构物。DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，互补的碱基对排列在内侧，磷酸基团排列在外侧，构成基本骨架。同一条DNA链上的核苷酸分子通过磷酸二酯键相连，通过碱基互补配对而身处不同DNA链上的核苷酸则是通过氢键相连。

第一代基因测序技术原理正是基于DNA的结构组成，先后经历了“初级”的化学降解法、小片段重叠法、引物延伸策略、加减测序法等逐步成熟至现在常用的自动化测序，下面主要介绍三种取得阶段性“胜利”的第一代基因测序技术。

▉ 1 化学降解法

总的来说，Maxam-Dilbert的化学降解法，是先对DNA片段的5’或3’末端进行放射性标记（通常使用³²P），再采用特异性化学试剂修饰和裂解特定的碱基位点，从而得到有着共同放射性起点，但长度大小不一的DNA片段混合物。以修饰后的特定碱基结尾的DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经过放射自显影技术检测末端被标记的分子，最后进行自下而上的直接识读DNA碱基序列。

方法：

1）待测DNA末端放射性标记，一般使用³²P标记链的5’或3’末端。

①T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-³²P-ATP标记待测样本5’末端；双/单链-双/单端标记

②末端转移酶和α-³²P-dNTP标记待测样本的3’末端；双/单链-双/单端标记

③DNA聚合酶Klenow片段和α-³²P-dNTP标记有5’突出端的待测DNA样本的3’末端；双链补平-单端标记

三种方法都可以放射性标记长度不一的DNA片段。

当使用①②方法时，每条链的5’或3’末端都会被标记，当其进行碱基特异性化学降解时，会产生两套重叠带有不同末端标记的DNA片段混合物，因此，必须分离两链或互补其中一条链，使得混合物末端标记单一，才能测序。此时，一般可将双链DNA变性后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳使两链分离或使用两种核酸限制性内切酶切割，进而获得大小不同的相同末端DNA片段。

2）特异性碱基修饰及降解反应

进行放射性标记后的待测DNA片段，使用表1-1中的化学试剂分别同时进行特异性碱基修饰，被修饰的碱基易与糖基分离，磷酸二酯键断裂而产生各种大小的DNA片段。

PS：简单的说，对待测的DNA片段混合液进行某个碱基体系修饰，即为片段末端只能以该碱基结尾，无法结合其它碱基。比如，碱基体系为C，则混合液中所有片段均以C结尾；而C T体系，则是以C或T结尾。

表1-1 化学降解测序法碱基特异性化学修饰常用试剂及反应部位介绍

3）DNA碱基序列的识读

放射性标记及特异性碱基修饰的DNA片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳，将其按大小分开，经放射自显影显示末端标记的碱基。自胶底部从下向上逐步读取条带（即碱基序列）。特异性特异性碱基修饰并非绝对的碱基特异性反应，在识读是通常是将G A与G泳道对比而推出A碱基，同样，C T与C对比推出T碱基（见下图）。

Ps：识读时，在胶的最底部找到该段序列的首个碱基，再通过和其它泳道的对比，依次推出第二、三、四……个碱基。

至此，测序初始阶段的化学降解法大致包含以上三个步骤，在当时，该方法因仅需要简单的化学试剂和普通的实验条件而被掌握，且其对DNA甲基化、G C含量较高的序列都普遍适用，但是该方法对DNA的纯度要求很高，且由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果的限制，其读长仅为200-250 nt，且放射性标记及化学试剂的的使用是存在一定安全隐患，因此并未成为主流的测序手段，目前只在分析某些特殊DNA序列及DNA与蛋白质相互作用中DNA的一级结构时才会使用。

▉ 2 双脱氧链终止法

在介绍第二阶段性“胜利”时，需要先介绍下加减测序法，双脱氧链终止法（常说的Sanger测序基本原理）则是基于该方法的2.0版。

加减测序法首次运用了特异性引物，以放射性核素标记标记的dNTP为原料，在DNA聚合酶（来源不同的聚合酶具有不同的功能，通常包括：5’-3’聚合酶活性、3’-5’外切酶活性、5’-3’外切酶活性等）作用下，先后进行DNA链的延伸和特异性终止反应。特异性的终止反应即分为利用DNA聚合酶3’-5’外切酶活性，分别只加入一种dNTP的“加法”反应和利用DNA聚合酶5’-3’聚合酶活性，分别加入三种dNTP的“减法”反应。

以dTTP为例描述“加减法”过程：

加法即是将延伸得到的产物分成四份，取其中的一份加入dTTP，由于可利用的碱基单一，DNA聚合酶行使3’-5’外切酶活性，产物从3’-5’方向发生降解，在此过程中，如果遇到以T结尾碱基，降解反应停止，DNA片段均以T碱基结尾，跑胶、识读即可。

减法即是将延伸得到的产物分成四份，取其中的一份加入除dTTP外的其它三种碱基，DNA聚合酶行使5’-3’聚合酶活性，合成反应过程中遇到T碱基，反应即刻停止，得到的DNA片段均是以T碱基前一个碱基结尾，进而推测T碱基位置。

加减测序法的结果并不尽如人意，片段不均一导致了个别碱基的重读和漏读，误差较大，因此Sanger和Coulson在测序中引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为终止剂，创建双脱氧链终止测序法（又称Sanger测序或酶法），这是DNA测序进程中的重大突破。

其原理是以单链DNA为模板，以dNTP为底物，在引物和DNA聚合酶作用下，催化dNTP的5’磷酸基团与引物的3’-OH末端生成3’,5’磷酸二酯键（此时PCR技术还没有出现），互补的DNA链从5’-3’的方向进行延伸（划重点：得到的是互补链的5’-3’序列哦）。ddNTP随机掺入链中，而由于其五碳糖3’位置缺少-OH，而不能形成磷酸二酯键，进而终止链的延伸。最终，产生4组分别终止于互补链的3’末端每一个ATCG位置上DNA片段的混合物，再进行跑胶、识读，进而推断出待测DNA链的碱基序列（见下图）。

Ps：识读时需要注意的是，直接按照胶图从小到大进行识读时的顺序是待测DNA链互补链的3’-5’的序列，按照碱基互补配对原则识读时即为待测DNA链的5’-3’的序列。

Sanger测序法是最经典的一代测序技术，是后面测序技术的基础，且直到现在都还是基因序列测定的“金标准”。在精准医学时代，Sanger测序法也仍发挥其重要作用（后续会陆续介绍，星标关注'药学速览’吧）。

▉ 3 自动化测序

第一代基因测序技术实现自动化主要依赖于以下几个方面：

1）PCR技术的诞生：Sanger测序中DNA聚合酶在自动化测序中被耐高温且高效的Taq DNA聚合酶代替，利用热循环仪高效能的自动循环，即可在单一引物引导下以DNA双链为模板进行扩增；

2）荧光素标记ddNTP：在荧光素没有被利用之间都是使用放射性核素（如³²P和³⁵S）标记dNTP和ddNTP。单色荧光标记和多色荧光标记则使该技术变得更加安全、高效，特别是多色荧光标记，其可标记4种ddNTP，使之与测序产物碱基间形成专一的对应关系，延伸终止后通过荧光谱带区分不同的碱基信息，且只需进行1个测序反应；

3）荧光信号接收器和计算机信号分析系统的出现：二者的出现替代了放射自显影技术，且使得同时快速分析多个样本成为了可能，大大降低了时间和人力的消耗。