Science突破！I will find you-设计识别表面‘抗原组合’蛋白开关系统精确定位杀伤...

▉ 写在前面

在上次介绍完David Baker后，许多朋友对蛋白质从头设计很感兴趣。那么今天再给大家分享蛋白质设计领域的大牛------华盛顿大学的David Baker（从头设计蛋白领域的领军人物）团队发明的技术，蛋白质开关系统(Co-LOCKR)。恰巧也是最近刚刚发表在Science的文章。一个经过改造的蛋白质开关系统(Co-LOCKR)可以通过识别细胞表面抗原组合来定位杀伤细胞。

了解David Baker的朋友应该知道，早在1998年，David Baker团队开发了一种用于蛋白质结构预测的Rosetta算法平台，利用这个平台构建虚拟的氨基酸链，然后计算出它们最容易折叠的形式；紧接着其团队创建了一个外延项目Rosetta@home，主要研究所有潜在的蛋白折叠，随后，他们还添加了一个叫作Foldit的在线游戏网站，可以让用户的独特蛋白折叠观点指导Rosetta的计算，这一切使得蛋白质从头设计不再遥不可及。

了解David Baker的朋友应该知道，早在1998年，David Baker团队开发了一种用于蛋

目前Baker的团队已经掌握了蛋白折叠的规律，他们已开始利用这些知识尝试“超越大自然的创作物”。他们开创了人类从头开始创建复杂跨膜蛋白的先河，近年来，在新的癌症治疗产品、疫苗、纳米材料等方面不断有新的突破。他相信，蛋白质设计这一新兴领域将从根本上改变人类在全世界制造药物、材料和更多东西的方式。

▉ 内容

抗体进行疾病治疗的原则是抗体能识别非健康细胞如肿瘤细胞表面特定的抗原，从而免疫细胞才能精确靶向杀伤或者解除免疫抑制等。但人体是非常复杂的一个系统，要想在这些联系非常紧密的混合细胞群中找到特定的目标不是一件简单的事情。具有独特表面标记的细胞可以被抗体靶向，但单个标记很少足以识别特定的细胞类型。双特异性抗体可以通过同时结合两个靶点来达到一定的选择性，但这种策略需要精细调整抗体的结合亲和力，以减少与表达一个靶点的健康细胞的相互作用。

基于此，他们想寻找一种根据细胞表面蛋白质的特定组合来区分不同细胞的方法。他们开发了依赖于共域化的蛋白质开关(Co-LOCKR)，该系统能够以多个事件为输入，进行布尔逻辑操作计算组合(AND，OR，NOT)，并生成单个输出。这些开关只有在满足所有条件时才能通过构象变化激活，在复杂细胞群中产生快速的、不依赖转录的反应。他们使用AND 计算方法来增强T细胞识别表达两种表面抗原的肿瘤细胞的能力，同时避免识别单靶点抗原的细胞。或者3种抗原输入，进行NOT或OR逻辑计算的开关来避免或识别表达第三种抗原的细胞。因此，新设计的蛋白质可以在细胞表面进行计算，将多种不同的结合作用整合成一个单一的输出（图1）。

图1

其实早在2019年，David baker 团队就设计了一种叫LOCKR的系统，这个系统能将你关心的功能组件都融合进去，随后即可使用这个系统进行定量的正交的蛋白质活性控制。

LOCKR系统包含Cage(蓝绿色)、Key（绿色）和Latch（蓝）三个结构，利用这个系统中蛋白质二级结构中，分子间与分子内的结合力竞争来控制蛋白质的构象改变——简而言之，在没有Key时，包含生物活性修饰（橘黄色）的Latch区域被Cage所结合控制，其生物活性修饰区域朝向蛋白质内部，活性被“锁住”，而在有Key存在的条件下，Key优先结合到Cage中将有生物活性的Latch释放出来（图2）从而结合到目标靶点（黄色）。

图2

通常依赖于共位点化的蛋白开关是打开的，这样Cage和Key在溶液中不会相互作用，但结合到细胞表面特定靶点时，它们会发生强烈的相互作用（图3）。

图3

为了评估Co-LOCKR精确结合多种表面抗原的能力，他们运用了四种K562工程细胞来验证Co-LOCKR系统的可行性。这四种K562细胞分别是单独表达Her2-eGFP、单独表达EGFR-iRFP、同时表达Her2-eGFP和EGFR-iRFP、不表达任何抗原的 K562细胞。LOCKR系统中的Cage以Her2为靶点， Key以EGFR为靶点，如果系统按照设计的方式运行，只有同时表达Her2和EGFR的细胞才能激活Co-LOCKR。实验结果正如他们猜想的一致，只有同时表达Her2和EGFR抗原的细胞才能激活LOCKR开关，而单独表达其中任何一个抗原的细胞都不能（图4）。

图4

精彩的地方来了！我们前面提到说这个系统不仅仅可以同时识别两个抗原（1 AND 2）；还可以执行布尔逻辑OR计算（1 AND（2 OR 3））或者NOT计算（1 AND 2 NOT 3）。他们在表达不同Her2、EGFR和EpCAM抗原组合的K562细胞中成功验证了LOCKR 系统的这三种计算组合(AND，OR，NOT) （图5）。

图5

同时，当CAR-T 细胞与AND/OR /NOT Co- LOCKRs 共培养时，可以根据运算结果选择性的杀伤目标肿瘤细胞。特别要注意的是，NOT运算中，抗原3的表达水平必须高于抗原2（图6）。

图6

▉ 总结

David baker 团队的CAR-T细胞实验证明了Co-LOCKR在体外靶向肿瘤细胞特异性的潜力。然而，要使Co- LOCKR成为一种临床治疗方法，还需要进行研究来评估和改进Co- LOCKR 在人体内的药物动力学。类似于任何其他由非人类蛋白组成的系统，该系统的的免疫原性也是一个潜在的问题。目前他们的工作主要集中在Co-LOCKR系统和CAR - T细胞应用的开发上，但Co-LOCKR系统有非常广泛的应用前景，它对于任何需要基于邻近激活或针对特定细胞亚群环境下的工程生物学来说都是值得尝试的方法。

参考资料:

1.  R. A. Langan, S. E. Boyken, De novo design of bioactive protein switches. Nature 572, 205–210 (2019).

2. Marc J. Lajoie, Scott E. Boyken, Designed protein logic to target cells with precise combinations of surface antigens. science.aba6527 (2020).

3.https://www./talks/david_baker_5_challenges_we_could_solve_by_designing_new_proteins