【原】IF=8.775，m5C纯生信文章，下一个爆点？

导语

今天给同学们分享一篇关于m5C相关分子亚型纯生信文章 “ 5mC regulator-mediated molecular subtypes depict the hallmarks of the tumor microenvironment and guide precision medicine in bladder cancer ”，这篇文章于今年发表在 BMC Medicine 杂志上，影响因子=8.775。本研究基于5mC调节剂的分子亚型分类反映了BLCA生物异质性，并为BLCA中的精准医学提供了新的见解。

1.生信分析揭示5mC的聚类情况

图1A显示了5mC调节因子在TCGA-BLCA队列中的预后价值、相关性和5mC调节器的综合情况。根据21个5mC调节因子的mRNA表达，TCGA-BLCA队列被分为几个簇。值得注意的是，只有当队列被分成两个聚类时，聚类算法才具有优越性，并且不同的聚类具有显着的预后价值。因此，135例患者被分为5mC第1组，其余患者被分类为5mC第2组。图1B显示了5mC簇与临床病理特征之间的相关性。显然，5mC调节器在两个5mC簇之间有差异表示。5mC第2组患者的预后比5mC第1组患者差（图1C）。进一步的多变量Cox分析表明，在调整分期，等级，年龄和LVI后，5mC簇是一个独立的预后因素（图1D）。

图1 TCGA-BLCA队列中5mC簇的临床相关性

2.5mC基因特征，5mC评分及其功能分析

图2A显示了5mC评分算法。首先，作者在两个5mC簇之间鉴定了401个差异基因（图2B）。然后，作者突出显示了具有最显著的差异基因（|log2FC|>2.5）在火山图中（图2C）。有趣的是，这些突出的差异基因中的大多数是BLCA分子亚型特异性标记。KRT6A、KRT6B、KRT6C、KRT5、KRT14、SERPINB3、SERPINB13、SERPINB4和DSG3是基础亚型特异性标志物。相比之下，UPK1A、UPK2、UPK3A、KRT20 和 SNX31 是腔内亚型特异性标志物（图 2C）。这表明5mC簇可能与经典的BLCA分子亚型相似。5mC基因特征的功能在免疫相关过程中明显富集。例如，BP主要富集leukocyte chemotaxis和myeloid leukocyte migration（图2D）；MF主要富集chemokine/cytokine receptor binding和chemokine/cytokine activity（图2D）。细胞组分（CC）主要富集the MHC protein complex and keratin filament（图2D）。此外，5mC基因特征中最重要的KEGG通路是细胞因子 - 细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路（图2E）。这些数据表明，5mC簇（5mC基因特征）可能在调节TME免疫和调节BLCA抗癌免疫应答中起关键作用。在5mC基因特征中，88个差异基因具有预后价值。然后，作者根据这些预后差异基因进行PCA以计算5mC评分。最终，根据5mC评分的最佳临界值，将TCGA-BLCA队列分为高5mC评分组（n = 197）和低5mC评分组（n = 203）。高分组患者预后优于低分组患者（图2F）。正如预期的那样，5mC评分可以有效地量化5mC簇。5mC聚类1属于高5mC评分组，低5mC评分组属于5mC聚类2（图2G-H）。

图2 5mC基因特征、5mC评分及其功能分析

接下来，作者比较了5mC评分组之间的突变谱，标志性通路，致癌通路和KEGG通路的差异。大多数标志性通路在两个5mC评分组之间差异富集（图3A）。大多数代谢标志性特征在高5mC评分组中显著富集。相比之下，在低5mC评分组中，大多数增殖相关标志性特征，DNA损伤相关通路，发育相关通路和细胞成分相关通路显着富集。特别是免疫相关KEGG通路在低5mC评分组中显着富集。这表明低5mC评分组（5mC聚类2）可能对ICB更敏感。先前的一项研究表明，TP53和RB1突变诱导基因组不稳定并促进BLCA的发病机制。在这项研究中，低5mC评分组的TP53（55%对40%）和RB1（27%对9%）的突变率明显高于高5mC评分组（图3B-C，图4D、E）。同时，大多数致癌通路在低5mC评分组中显着富集（图3D）。这些结果可以解释为什么低5mC评分组（5mC簇2）预后较差。总的来说，5mC基因特征和5mC评分全面反映了BLCA的生物学特征，包括TME免疫和预后。

图3 5mC评分组的功能分析

3.5mC簇可准确预测BLCA的治疗预后

图4A，B显示了5mC簇，5mC评分组和7个经典分子亚型分类之间的相关性。高5mC评分组和5mC簇1代表腔内亚型，其特征在于luminal differentiation, urothelial differentiation和the Ta pathway。相反，低5mC评分组（5mC簇2）显示基底亚型，其特征为basal differentiation、EMT differentiation、immune differentiation、interferon response和keratinization。ROC曲线显示，5mC评分预测经典分子亚型，精度范围为0.91~1（图4C）。因此，作者认为5mC簇系统也可以反映大多数BLCA患者的分子特征。在所有分子亚型系统中都观察到这种现象。因此，5mC评分可以定量反映其他稀有亚型的生物学特征。5mC评分较高的患者具有较高的肿瘤纯度，这表明TME中的免疫和基质浸润较低。一致，具有较高5mC评分的样品代表具有较低免疫浸润和基质特征富集评分的腔内亚型（图4 A）。5mC评分与纯度之间的闭合相关性可能是由于5mC基因特征包含许多免疫相关基因。总体而言，肿瘤纯度更倾向于被视为TME内部特征，反映了基质和免疫相关特征。低5mC评分组新辅助化疗相关基因的总突变率显著高于高5mC组（图4D，E）。这表明低 5mC 评分组的患者可能对新辅助化疗更敏感。同时，低5mC评分组的患者可能对EGFR靶向治疗和放疗更敏感（图4F）。相比之下，在高5mC评分组中，几种免疫抑制致癌通路显著富集，包括WNT-β-catenin网络，PPARG网络，FGFR3网络，IDH1，KDM6B和VEGFA。因此，靶向这些致癌通路可能为高5mC评分组的BLCA患者提供有希望的治疗机会。此外，作者在DrugBank数据库中成功确认了上述结果（图4G）。低5mC评分组（5mC第2簇）的患者对化疗药物（cisplatin, docetaxel和gemcitabine）、ERBB therapy(cetuximab)和immunotherapy (atezolizumab)。然而，高 5mC 评分组（5mC 簇 1）的患者可能对抗血管生成治疗药物（sorafenib和bevacizumab）更敏感。总的来说，5mC簇可能是经典分子亚型的经济和更简单的替代品。同时，5mC簇和5mC评分可以预测BLCA中几种治疗的反应。

图4 5mC簇准确预测了经典分子亚型和治疗机会

4.5mC簇预测了BLCA中ICB的免疫表型和临床疗效

大多数免疫调节剂在5mC簇1中下调。由于癌症免疫周期的活性直接由免疫调节剂的综合性能决定，因此大多数癌症免疫周期的活性在5mC簇1中被下调，例如癌细胞抗原的释放，免疫细胞向肿瘤的运输（CD8 T cell recruitment, CD4 T cell recruitment, macrophage recruitment, Th1 cell recruitment, NK cell recruitment, DC recruitment）和癌细胞的杀伤（图5A）。因此，这些循环的下调活性导致BLCA TME中相应TIIC（包括CD8 T细胞，CD4 T细胞，NK细胞，Th1细胞，巨噬细胞和DC）的浸润水平降低（图5B，C）。这些发现表明，5mC簇1可能是一种非发炎表型。作者进一步分析了5mC聚类与ICB反应预测因子之间的相关性。首先，大多数免疫检查点，如PD-L1，PD-1和CTLA-4，在5mC簇1中被下调（图6A）。其次，阳性ICB响应相关特征和TIS在5mC簇1中的富集评分明显低于5mC聚类2（图6B，C）。因此，5mC簇1可能对ICB不敏感。

5mC评分与BLCA TME的抗癌免疫呈负相关。大多数免疫调节剂在高5mC评分组中下调。始终如一地，5mC评分与大多数癌症免疫周期的活动呈负相关（图5D）。结果，5mC评分与许多抗癌TIICs（包括CD8 T细胞，CD4 T细胞，NK细胞，Th1细胞，巨噬细胞和DC）及其效应基因呈负相关，这些基因在七种独立算法中进行了交叉验证（图5D，E）。此外，5mC评分与TIS、ICB应答相关阳性特征的富集评分和免疫检查点之间存在显著的不良相关性（图6D，E）。

总之，5mC簇1和高5mC评分预测BLCA中无炎表型和较低的ICB反应，这在几个外部队列中成功证实。此外，在高 5mC 评分组中，ICB 相关高进展的发生率可能更高。在5mC评分高组中，与ICB相关过度进展呈正相关的基因（包括MDM2、MDM4、DNMT3A、CCND1、FGF3、FGF4和FGF19）的mRNA表达和拷贝数扩增率显著较高（图6F，G）。相比之下，与过度进展呈负相关的基因，如CDKN2A和CDKN2B，在5mC评分较高的组中显着下调。

图5 5mC簇和5mC评分与队列中的免疫表型相关

图6 5mC聚类和5mC评分与队列中ICB反应的预测因子相关

5.验证5mC评分在湘雅队列中的作用

在作者自己的队列（湘雅队列）中，作者发现5mC评分可以准确地预测经典分子亚型（图7A）。AUC的范围从0.99到1，除了在Baylor subtype system（AUC = 0.9）（图7B）。此外，5mC评分与许多抗癌免疫步骤的活性呈负相关（图7C）。随后，5mC评分也与7种独立算法中CD8 T细胞、NK细胞、Th1细胞、DC和巨噬细胞的浸润水平呈负相关（图7F）。同时，5mC评分与免疫检查点，TIS和阳性ICB反应相关特征的富集评分之间存在显着负相关（图7D，E，G）。这些数据表明，5mC评分可以有效地对BLCA的免疫表型进行分层。此外，5mC评分能够预测对其他治疗的临床反应，包括EGFR靶向治疗，放疗和几种针对免疫抑制致癌通路的疗法（图7H）。

图7 验证5mC评分在湘雅队列中的作用

6.5mC评分的泛癌分析

作者进一步评估了5mC评分在癌症中的作用。值得注意的是，5mC评分与许多癌症的预后有关，例如胸腺瘤，低级别胶质瘤和肾肾透明细胞癌（图8A）。此外，在大多数癌症中，5mC评分与四个关键免疫检查点PD-L1，PD-1，CTLA-4和LAG-3的表达呈负相关（图8B-E）。异常的DNA甲基化可能会影响癌症的免疫原性，例如TMB和MSI。在这里，作者发现5mC评分与许多癌症中的TMB和MSI有关（图8F-G）。因此，5mC评分在泛癌分析中反映了TME的许多生物学特征，如抗癌免疫力、免疫原性和癌症干度。它可能是癌症预后和ICB反应的可推广预测因子。

图8 5mC基因特征的泛癌分析

7.5mC评分是多个免疫治疗队列中免疫治疗反应的宝贵预测因子

在这里，作者探索了5mC评分在预测来自九个免疫治疗相关队列的其他癌症中的ICB反应中的作用。首先，作者发现5mC评分与八个ICB队列中的大多数免疫检查点呈负相关。与此相一致，高5mC评分组的ICB反应率明显低于5mC评分组（图6A-G）。由于ICB反应率较低，高5mC评分组的预后也较差（图9A-G）。在过继性T细胞治疗队列中观察到类似的结果（图9H）。这一证据再次证实，5mC评分是癌症免疫治疗反应的宝贵预测因子。

图9 5mC评分预测了几个免疫治疗队列对免疫治疗的反应

小结

在这项研究中，作者基于5mC调节剂的新型亚型系统反映了膀胱癌的异质性，并为膀胱癌治疗提供了新的见解。5mC评分能够量化5mC亚型，鉴定不同的分子亚型，并对BLCA的治疗机会进行分层。同时，5mC评分可能是癌症ICB反应和预后的可推广预测因子。对5mC思路（肿瘤或非肿瘤）感兴趣的老师，欢迎扫码咨询。

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