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一、肽酶，南美白对虾生长发育的关键性因素 肽酶是一种水解酶，可以在蛋白质链中裂解肽键。根据其催化机理及参与底物水解的氨基酸种类，将其分类为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属肽酶。在节肢动物中，肽酶对孵化、免疫、变态、幼虫发育、营养和寄生虫入侵等多种生理过程中发挥着关键作用。因此，肽酶(也被称为蛋白酶或蛋白水解酶)被认为是通过干扰其活性，来控制寄生虫和昆虫的靶点。 节肢动物幼虫发育过程中。蛋白水解酶的相关性在经济相关的昆虫中被广泛描述，肽酶是蜕壳和变态的触发器，并参与脂肪体细胞分解和组织重塑。对于甲壳类动物，幼虾中肽酶的描述主要集中在胰蛋白酶、糜蛋白酶等参与食物消化的酶。在幼虾发育过程中表达的肽酶的表达谱，显示出不同的表达取决于酶和幼虾的生长阶段，但这表明肽酶参与了十足动物的发育。 南美白对虾是一种经济效益高的对虾，分布在北美洲，中美洲和南美洲东太平洋海岸的热带海洋环境中。对虾经历多种生命周期，包括受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾、仔虾、幼虾。幼体通过在相对较短的时间内（取决于温度，为11至17天）发生一系列蜕变而逐渐发育，每个阶段都表现出符合其行为、生理和生态适应性（图1）。 图1：南美白对虾的幼体发育阶段 虽然南美白对虾是水产养殖业的关键物种，其人工养殖非常成功，对包括幼虫发育在内的许多重要生理过程的分子机制的研究很少。但是，对自然资源，生态学，遗传学和养殖技术的掌握，需要对物种的发育生物学有深刻的了解。 在这项工作中，通过转录本和活性的方法来评估南美白对虾幼虫发育过程中的蛋白水解谱。我们用qPCR方法对14个注释的虾肽酶的基因表达进行了定量分析。由于mRNA丰度的变化不一定与相应的成熟蛋白产物相关，因此也使用设计用于丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属肽酶水解的荧光底物来评估蛋白水解活性，并使用类特异性抑制剂来确认其比活性。 二、研究结果： 1、南美白对虾幼虾发育过程中的肽酶基因表达谱 在南美白对虾幼虾的整个发育过程中，所选肽酶的基因表达模式很容易在热图中显示出来(图2)。类似的表达模式通过Pearson相关相似性和平均连锁距离的层次聚类计算。检测到三个主要的簇(从上到下的簇): 图2：南美白对虾幼虾肽酶的基因表达 a)主要在zoeal和mylysis阶段表达的肽酶，这是一个由编码丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸类肽酶的4个基因组成的不同的组； b)肽酶在十足期高度表达，这是由7个基因组成的较大的类群，包括被描述为食物蛋白消化体的肽酶，如胰蛋白酶，糜蛋白酶和组织蛋白酶； c）肽酶主要表达于无节幼体早期龄期，由半胱氨酸肽酶B、组织蛋白酶L和组织蛋白酶c组成。 2、南美白对虾幼虾发育过程中的肽酶活性谱 测定了四种肽酶的蛋白水解活性。为了定量半胱氨酸肽酶活性，使用了3种底物:z - pheu - arg↓AMC、Z-Leu-Arg↓AMC和Z-Val-Val-Arg↓AMC(箭头表示剪切键位置);虽然这些底物被甲壳类半胱氨酸肽酶识别并有效切割，但它们也可能被其他非半胱氨酸肽酶水解，因此只考虑对半胱氨酸肽酶抑制剂E-64敏感的部分活性。与热图中观察到的半胱氨酸肽酶基因表达一致(图2，低簇)，在早期幼虾阶段观察到活性峰值(图3A)。这种活性可以归因于组织蛋白酶L(图3B)、组织蛋白酶C(图3C)和蛋白酶B(图3D)，因为这些基因在无节期表现出最高的表达。 图3：半胱氨酸肽酶基因表达和整个南美白对虾幼虾发育的酶活性 以MCA-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe↓Phe-Arg-Leu-Lys(DNP)-DArg-NH2为底物，测定天冬氨酸肽酶活性，该底物可被多种脊椎动物和无脊椎动物的组织蛋白酶D和组织蛋白酶E水解。在幼虾发育过程中观察到的天冬氨酸肽酶活性一般是恒定的。在zoea期和mysis期增加（图4A），南美白对虾表达至少一种组织蛋白酶D转录本。我们的结果表明，一般而言，在mysis阶段的基因表达达到峰值（图4B）与在zoea和mysis晚期发现的活性相匹配。 图4；天冬氨酸和金属肽酶基因的表达和酶活性，贯穿于南美白对虾幼虾发育的全过程。 丝氨酸肽酶是南美白对虾研究最多的肽酶类，胰蛋白酶和糜蛋白酶是南美白对虾消化道的主要肽酶。Boc-Phe-Ser-Arg↓AMC和uc- ala - ala - pro - phe↓AMC分别作为底物定量胰蛋白酶和糜蛋白酶活性(图5A和5C)。到目前为止，对胰蛋白酶底物的活性在幼虾发育过程中最为丰富，在zoea和myysis龄期达到最高值， 图5：丝氨酸肽酶基因的表达和酶活性，贯穿于南美白对虾幼虾的发育的整个过程。 三、研究讨论 南美对虾对子卵黄的主要蛋白质成分是卵黄蛋白，这是一种大的多亚基脂萝卜素蛋白，其降解产物是非饲喂幼虾发育所需的氨基酸和其他营养素的来源（见图1），其存活取决于蛋黄的营养储备。南美白对虾的半胱氨酸肽酶活性在幼虾阶段都很高（图3A），我们认为这种活性是卵黄蛋白水解的原因，尤其是组织蛋白酶L，组织蛋白酶C和钙蛋白酶被认为是负责卵黄蛋白水解的主要酶，因为它们在无节幼体阶段的表达明显较高（分别在图2和3B–3D中显示）。 肽酶在南美白对虾发育中影响的是蜕壳。老角质层的降解是通过几丁质酶和肽酶的分泌到蜕壳空间中完成。蜕壳周期是南美白对虾生长发育的基本过程之一，涉及肌肉纤维的重塑，这些肌肉纤维会经历肌蛋白肌动蛋白和肌球蛋白的降解，从而导致肌肉萎缩，这使肢体在蜕壳过程中从狭窄的开口中退出。在南美白对虾幼虾阶段，蜕壳的速度是非常快的，才能适应快速生长的需要。胰蛋白酶（图5A），胰凝乳蛋白酶（图5C），天冬氨酸肽酶（图4A）和金属肽酶活性（图4C））在幼虾发育的所有阶段都检测到，表明这些肽酶在蜕壳过程中的起到关键作用，其中胰蛋白酶基因的表达和活性是幼虾蜕壳频率增加的关键因素。 在这项研究中，我们描述了整个南美白对虾幼虾发育过程中半胱氨酸，天冬氨酸，金属和丝氨酸肽酶的mRNA表达和蛋白水解活性模式，这些酶表现出不同的表达和活性，表明它们在虾的幼体发育和变质中起着重要作用。如在卵黄降解、角质层转化和非必需组织降解等过程中发挥着不同的作用。 |
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