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解螺旋公众号·陪伴你科研的第2825天 相分离作为近年来逐渐备受重视的研究方向，让很多同学想要了解这个领域，甚至想要从中分一杯羹。这不就来给大家做综述文献分享了嘛，毕竟这个领域去年中了44个国自然项目，共获得了5693万元的资助。2021年8月2日，苏州大学生物医学研究所的周芳芳教授和浙江大学生命科学研究所张龙教授在影响因子18.187分的Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上发表了题为《Liquid-liquid phase separation in human health and diseases》的综述，系统性地为我们介绍了液相分离在人类生理状态和疾病状态下的功能作用。为了帮助大家更好的吸收综述的内容，葫芦娃本娃在阅读综述的时候，也给大家翻译了遍，希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。不断新出现的证据表明，液-液相分离（liquid-liquid phase separation，LLPS）表明在真核细胞中形成无膜细胞器（也被称为生物分子凝聚物或液滴）是一种重要而普遍的现象。最近的研究发现，LLPS在人类的健康和疾病中都发挥着重要作用。在本综述中，我们讨论了目前对LLPS的理解，总结了其生理功能，并进一步地描述了LLPS在人类疾病发展中的作用。此外，我们还回顾了最近所开发的研究LLPS的方法。虽然LLPS的研究还处于起步阶段，但发展迅速，显然LLPS在病理生理条件的发展中都起着重要的作用。这也表明需要概述该领域的最新进展，以便将我们将目前有关LLPS的知识转化为治疗性的发现。细胞水平上生物进化的一个明显特征是，从相对统一的细胞质环境中发展出多样化的细胞器结构。真核细胞含有各种细胞器，它们蕴含着不同的化学微环境，可以隔离分子和蛋白质以提高特定过程的反应速度。真核细胞有两种类型的细胞器，即：（a）有膜的细胞器，如内质网，它含有合成、加工和运输分泌蛋白所需的成分；（b）无膜的细胞器，如在小核糖核蛋白组装和核糖体生物生成过程中发挥重要作用的Cajal体。膜结合的细胞器的脂质双层膜允许将特定的蛋白质、核酸和其他分子封闭在一个有限的空间内，这一现象可使细胞器能够发挥它们的功能。这些蛋白质或核酸从细胞器中泄漏可能会导致严重的后果；例如，细胞色素c释放到细胞质中会导致细胞凋亡，核酸释放到细胞质中会导致先天性免疫途径的激活。相比之下，无膜细胞器没有任何包裹性的膜来限制分子交换。这些无膜结构稳定地存在于真核细胞中，经常与周围的细胞质交换各种分子。细胞生物学的一个基本问题是：“这些无膜隔间（compartments）是如何组织起来，并在空间和时间上控制如此复杂的生化反应”。液-液相分离（LLPS）作为解释无膜细胞器形成及其功能的一种很有效的机制正逐渐被大家所接受。多价大分子的相互作用可以驱动某些蛋白质转变为具有不同理化性质的另一相，从而诱导无膜细胞器或细胞结构的形成。无膜细胞器和细胞结构都表现出比周围介质更高的蛋白质密度和更弱的分子运动，从而提高生化反应的速率。在大多数情况下，这些结构都表现出液体的特性，因此被描述为体状（bodies）、点状（puncta）、颗粒状（granules）、液滴状（droplets）和凝集状（condensates）。我们将凝聚物分为三组，即质膜、细胞质和核定位凝聚物。这些凝聚物在各种细胞过程中发挥着各种意想不到的（unexpected）作用（表1）。在本综述中，我们简要地回顾了LLPS概念的发展，并讨论了最近所发展出来的研究LLPS的方法。我们也强调了有关LLPS在调控转录、基因组组织、免疫反应和神经元突触信号方面的重要发现。我们也描述了LLPS在人类疾病中的作用，包括神经退行性疾病、癌症和COVID-19。尽管对LLPS的研究越来越多，但我们开始了解到这种现象在生理和疾病中所起的至关重要的作用。这也表明需要更新对该领域最新研究进展的概述，以将关于LLPS的现有信息转化为治疗性的发现。1899年Edmund Beecher Wilsonin提出了一个假说，即细胞的主要部分——细胞质，类似于不同化学悬浮液的混合物（图1）。然而，直到2009年，当Tony Hyman和Cliff Brangwynne发现P颗粒可表现出类似于液体的行为，并且其定位是由快速溶解/凝结（dissolution/condensation）所驱动的，研究人员才开始意识到LLPS可能是各种无膜细胞器组织的基础。2012年，迈克尔-罗森及其同事发现，当多价蛋白质相互作用时，随着蛋白质浓度的增加，它们会经历从小复合物到大聚合体的快速转变，并且这一现象伴随着宏观的LLPS。同年，Steven L. McKnight及其同事表明，LLPS决定了无细胞的体外反应中RNA颗粒的结构。上述两项研究表明，相分离很容易在试管中用简单的程序实现，这使得研究LLPS变得更加容易。从那时起，这一领域得到了扩展，许多研究团队都在研究LLPS。新的研究表明，LLPS参与了各种过程，如适应性和先天性免疫信号、应激颗粒的组装、异染色质的形成、转录、miRISC组装、自噬。LLPS还在癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病的发展中起作用。研究发现，两种类型的多价相互作用可导致LLPS（图2），即细胞内蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA和RNA-RNA的相互作用，以及固有无序区（IDRs）之间弱、瞬时的多价相互作用，包括π-π相互作用、阳离子-阴离子相互作用、偶极-偶极相互作用和π-阳离子相互作用。LPPS可以被描述为细胞内电化学梯度力的产物，这些梯度是由多价相互作用所建立的，它可影响液滴中分子的空间排列，也可受其影响。鉴定和研究液相分离（liquid separation）的方法 如前所述，研究已经表明LLPS参与了各种细胞过程。研究液分离的方法也正在研发中，我们将在下文对其进行回顾。目前学界已经开发了一些工具来预测靶标蛋白进行相分离的能力（图3a）。例如，D2P2数据库可预测无序和结合位点、蛋白质家族结构域以及翻译后修饰的信息。除了对无序区域的预测，还有一些相分离数据库可提供实验验证了的LLPS信息，并整合了关于生物物理驱动力、生物功能和这些分子系统调节的广泛信息。这些分析工具或数据库可以帮助我们快速预测或分析靶标蛋白的相分离能力。显微镜是观察这些生物分子凝聚物（condensates）结构和组成的重要工具（图3b）。共聚焦显微镜和超分辨率成像的最新进展为生物分子凝聚物提供了更详细的信息。例如，使用超分辨率成像揭示了SARS-CoV-2 N蛋白+RNA+M蛋白凝聚物的核壳结构。然而，这两种技术的缺点是凝聚物必须用抗体染色或荧光标记的。电子显微镜也可以用来以无标签的方式精确观察生物分子凝聚物。显微镜和体外重组实验的结合被广泛用于研究LLPS。显微镜可用于研究从大肠杆菌、酵母或昆虫细胞纯化蛋白的相分离（图3c）。LLPS对一些因素很敏感，包括pH、温度、RNA、盐浓度和翻译后修饰。因此，我们可以在体外确定靶标蛋白的特定相分离条件。生物分子凝聚物的材料特性和动力学是其功能的决定因素。例如，凝胶状的N蛋白凝聚物可促进核壳的组装，而液体状的N蛋白凝聚物可促进病毒基因组的处理。生物分子凝聚物的材料特性和动力学可以用基于成像的技术来研究，包括光脱色荧光恢复（FRAP）、光脱色荧光缺失（FLIP）和荧光相关光谱（FCS）。在这些技术中，FRAP是使用最广泛的。在被激光脱色后，凝聚物的荧光会随着时间的推移而恢复（图3d）。凝聚物恢复的时间越短，流动性越高。尽管体外的研究有助于研究生物分子凝聚物的特性，但对这些生物分子凝聚物的体内组成、浓度和功能并不是十分了解。目前，研究人员也已经开发了一个基于光遗传学的系统，它可以利用蓝光调节多价态以促进或逆转体内生物分子凝聚物的形成（图3e）。这个系统被称为optoDroplet。拟南芥的蛋白结构域Cry2，可在蓝光激活后形成寡聚体，可与靶标蛋白的IDR相融合，并被荧光所标记。我们可以使用optoDroplet系统来研究凝聚物在促进体内生物功能或功能障碍方面的作用，而这是其他方法难以做到的。总的来说，这些新的方法可以让我们深入了解LLPS的作用机制和功能。转录是基因表达的重要组成部分。转录的调节异常可能会导致疾病的发生。因此，转录会受到各种因素的严格调节。在过去的几十年里，遗传学、生物化学、分子生物学和基因组学的研究已经发现了许多因素，如转录因子、共激活因子（coactivator）和增强子，它们在调节转录的过程中都起着至关重要的作用。然而，关于这些因素如何共同建立起复杂的调节过程却知之甚少。最近的研究表明，LLPS是这些因素控制转录的一种新调节机制。
RNA聚合酶（Pol）以DNA为模板催化RNA的合成。到目前为止，已经发现了三种真核生物的RNA聚合酶（Pol I、Pol II、Pol III）。Pol I催化大核糖体前体RNA的转录，Pol III合成tRNA和小rRNA，而Pol II被认为是最重要的RNA聚合酶，负责转录mRNA和各种非编码RNA。活细胞超分辨率显微镜的结果表明，Pol-II介导的转录发生在核凝聚物上，这也被称为簇、中心或焦点。这些核凝聚物可表现出液体的特性，即光脱色后荧光的快速恢复和对1,6-己二醇的敏感性，1,6-己二醇是一种可影响相分离的疏水性化合物。这些核凝聚物是由Pol II的LLPS和各种携带IDR的因子形成的（如转录因子和共激活因子）。有趣的是，这些核凝聚物不仅存在于启动子，也存在于由一组增强子组成的超级增强子中（图4b）。超级增强子比经典的增强子具有更高的转录因子和共激活因子密度，其功能是激活那些可决定细胞特性的关键基因的转录。这也是通过转录因子和辅助激活因子的相分离来实现的，这一过程部分性的是由IDR的弱和瞬时多价相互作用所驱动的。转录因子通常包含一个或多个具有无序结构的转录激活域和一个或多个具有特定结构的DNA结合域。最近的相分离研究进展表明，不同的转录因子，包括胚胎干细胞多能性转录因子OCT4、配体依赖性转录因子雌激素受体和酵母转录因子GCN4，均可以与共激活因子复合物Mediator形成相分离的凝聚物。Mediator可以稳定预启动复合物并促进转录，以招募Pol II固有的无序羧基末端结构域（CTD），从而启动靶标基因的转录。此外，Boehning等人还发现Pol II的CTD在分子拥挤剂（molecular crowding agents）的存在下可以单独形成凝聚物。这可能表明了CTD是转录凝聚物的靶标，而使Pol II被招募到活性基因上。转录有三个关键步骤，即启动、延伸和终止。转录启动后，Pol II不直接进入延伸阶段，而是在转录起始点下游约50 bp的区域暂停，这种现象称为启动子近端暂停。作为转录的一个关键限速步骤和重要的早期检查点，启动子近端停顿必须确保Pol II的正确修饰和新生RNA 5'端的加帽（capping）在Pol II进入伸长阶段之前被转录。最近关于LLPS的进展表明，从启动子近端暂停到转录延伸的过渡是由负延伸因子（NELF）和正转录延伸因子b（P-TEFb）通过相分离机制来调节的（图4a）。NELF通过稳定已暂停的Pol II来发挥转录延伸抑制因子的作用，而P-TEFb通过促进NELF和Pol II的磷酸化，使Pol II从暂停状态中释放出来，从而发挥转录延伸促进因子的作用。P-TEFb是由催化亚单位CDK9和调节亚单位CCCNT1组成的复合物。CCNT1中富含组氨酸的结构域可以与Pol II的无序CTD发生多价相互作用，促进P-TEFb相从已暂停的Pol II中分离成凝聚物。这使得CDK9不仅可以磷酸化Pol II的CTD，还可以磷酸化NELF。磷酸化的Pol II的CTD可与各种转录延长因子和RNA剪接因子发生相互作用，形成延长凝聚物，而促进转录。此外，NELF的磷酸化对于促进Pol II进入伸长阶段也是必不可少的。NELF是由四个亚单位组成的复合体，即NELFA、NELFB、NELFC/D和NELFE。有趣的是，NELF是通过NELFA的固有无序区进行LLPS。然而，在正常情况下，为了促进Pol II进入伸长阶段，NELF凝聚物通过磷酸化NELFA而均匀分布。当细胞处于应激状态时，失活的P-TEFb不能磷酸化NELF，而激活ZNF451（SUMO E3连接酶）以SUMO化NELF，从而促进NELF发生相分离。因此，NELF可以形成凝聚物来抑制管家基因的转录，以确保细胞生存。除了这些可以控制转录凝聚物的调控因子外，转录产物——RNA也可以通过反馈机制调节转录凝聚物的形成（图4b）。Jonathan等人发现，调节性DNA元件（超级增强子、增强子和启动子）的低水平RNA能促进转录凝聚物的形成，而高水平的RNA则能溶解转录凝聚物。由于RNA通常带负电荷，而蛋白质在溶液中通常带正电荷，他们认为转录凝聚物中的蛋白质和RNA之间的相互作用可被视为聚电解质。当转录凝聚物中的电荷相等时，RNA和蛋白质之间的相反电荷则会促进转录凝聚物的形成，而由RNA水平增加所产生的负电荷和RNA与RNA之间的排斥电荷则会导致转录凝聚物溶解。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在于细胞核内。染色质的基本功能单位是核小体，它包含约146bp DNA，包裹在组蛋白八聚体周围。组蛋白八聚体由两份组蛋白H2A、H2B、H3和H4的拷贝所组成。核小体通过接头（linker）DNA与组蛋白H1相连接。尽管我们对染色体的组成有了一定的了解，但对染色质组织和染色质分区的具体机制仍不甚了解。Michael K. Rosen小组最近的研究结果表明，染色质在生理盐分中会发生LLPS，这一现象是由带正电荷的组蛋白尾部所驱动的（图5a）。此外，他们还发现有几个因素可以调节染色质凝聚物的形成或性质。例如，接头组蛋白H1可促进染色质的LLPS并降低凝聚物的动力学，这与它在细胞中作为抑制性染色质结构因子的作用是一致的。核心组蛋白尾部发生超乙酰化后，染色质凝聚物可被溶解，而有利于转录的激活。除了染色质之外，一些特殊的reader能够识别相应的组蛋白修饰而通过LLPS参与调节染色质的分区（compartmentation）。
真核细胞染色体包含有各种功能区，这些功能区以特定的组蛋白修饰坐为标志。组成性异染色质主要为沉默的染色体区段，富含H3K9me2/3。H3K9me3的reader蛋白是异染色质蛋白1（HP1），它包含有染色体结构域（CD）、染色体阴影结构域（CSD）和三个无序区域，即N-末端延伸（NTE）、铰链和C-末端延伸（CTE）。CD可以与H3K9me3结合，而CSD则有助于HP1的二聚化；铰链区含有很多带正电荷的赖氨酸，负责与DNA或RNA结合（图5b）。最近，Strom等人发现了果蝇中的HP1同源物，即HP1a，它在生理条件下可以在体外形成较高浓度的液体状凝聚物，这可能会介导果蝇的早期胚胎中异染色质结构域的形成。在哺乳动物中，有三种类型的HP1同源物，即HP1α、HP1β和HP1γ。其中，只有HP1α能在体外高浓度和低盐浓度下发生LLPS，这是由其无序的NTE和铰链区所驱动的。有趣的是，随着时间的推移，HP1α的凝聚物会减少并表现出凝胶状的特性。这与HP1的功能相一致，即通过抑制转录因子与DNA的结合来介导组成性异染色质区域的基因沉默。NTE的磷酸化和核酸的加入都能促进HP1α凝聚物的形成。此外，当铰链区的赖氨酸突变为不带电的氨基酸时，HP1α发生相分离的能力会明显降低。这些结果表明，HP1α的相分离可能是由弱静电相互作用所介导的。除了静电相互作用，Wang等人表明CD和H3K9me2/3之间的相互作用也可以促进HP1的LLPS（图5b）。HP1二聚体可以与SUV39H1（一种H3K9me2/3的writer）和TRIM28（一种HP1支架蛋白）发生相互作用，分别形成SUV39H1/HP1复合物和TRIM28/HP1复合物。由于这些复合物含有多种可与H3K9me2/3相互作用的CD，所以它们可以与H3K9me2/3标记的核小体阵列（arrays）发生相分离，并通过多价相互作用形成凝聚物。总而言之，这些证据表明多价驱动的LLPS在基因组组织中起着重要的作用。人类的免疫系统包括先天性免疫和适应性免疫。T细胞和B细胞是参与适应性免疫的主要细胞类型，它们具有一些特异而独特的受体。大量的B淋巴细胞包含有很多种B细胞受体（BCR），从而增加遇到与BCR特异性结合的抗原的概率。然而，B细胞的克隆扩增过程需要3至5天，这可能给予了病原体足够的时间来繁殖并造成损害。与适应性免疫相比，先天性免疫可以在病原体入侵后迅速被激活。它是人体抵抗病原体入侵的第一道防线，直到B细胞产生足够数量的抗体。
在脊椎动物中，当病原体入侵时，先天性淋巴细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，通过模式识别受体（PRRs）识别并与病原体相关分子模式（PAMPs）或危险相关分子模式（DAMPs）结合，从而诱导促炎因子、干扰素和数百个干扰素刺激基因（ISG）的表达。这些效应器可帮助宿主迅速处理掉入侵的病原体。PAMPs是一组高度保守的分子结构，为特定的微生物病原体及其产物所独有。最著名的PAMPs例子包括单链或双链RNA、病毒DNA和革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）。PAMPs不存在于宿主体内；因此，它们会被先天性免疫细胞视为感染的分子特征。目前已发现了多种PRRs。根据它们在细胞中的定位，可以分为两类：第一类PRRs位于细胞膜上，如Toll样受体（TLRs）；第二类PRRs定位在大多数细胞的细胞质中，如RIG-I样受体（RLRs）和环状GMP-AMP合成酶（cGAS）。DNA感应蛋白cGAS可以通过利用ATP和GTP催化产生环状GMP-AMP（cGAMP）。衔接蛋白STING可被cGAMP激活，从而诱导I型干扰素。在被细胞质DNA（如病毒DNA）激活后，cGAS和DNA可以在细胞质中形成“病灶（foci）”。长期以来，我们一直不了解这些“病灶”的具体分子机制和功能。Du等人最近的一项研究发现，cGAS“病灶”是由cGAS和DNA之间通过LLPS的多价相互作用形成的（图6a）。具体来说，无序和带正电的cGAS N端结构域（NTD）和长DNA之间可以通过增加价位（静电相互作用）来促进cGAS-DNA的LLPS。cGAS-DNA凝聚物可作为一个反应坩埚（crucible），它可以浓缩（concentrate）反应物（ATPs和GTPs）和酶（激活cGAS）以有效地产生cGAMP。同样，RLRs，如RIG-I和MDA5，也可以感知病毒核酸（DNA或RNA），从而通过TBK1/IKK信号传导途径启动抗病毒免疫反应。然而，目前仍不清楚RLRs是否可以与核酸发生相分离，以促进抗病毒免疫反应。此外，为了逃避免疫系统的监视，病毒可以通过操纵一些重要的蛋白来抑制这些感应蛋白凝聚物的形成，而这些蛋白可以促进感应蛋白的相分离或激活。例如，G3BP1是先天性免疫反应（包括RIG-I介导的细胞抗病毒途径和cGAS-STING途径）的正向调节因子，也是一种应激颗粒的核心蛋白。SARS-CoV-2的N蛋白可以形成包含RNA和G3BP1的凝聚物，以抑制G3BP1和cGAS或RIG-I之间的相互作用，从而抑制宿主细胞的抗病毒免疫反应。除了先天性免疫反应，LLPS还可介导适应性免疫反应的信号转导（图6b）。T细胞受体（TCR）的信号转导对T细胞的激活至关重要。在被Src家族的激酶Lck磷酸化后，TCR的细胞质结构域可招募并激活酪氨酸激酶ZAP70。跨膜蛋白LAT的多个酪氨酸残基可被活化后的ZAP70磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基可招募含有SH2和SH3结构域的蛋白GRB2、Gads和Sos1，从而通过多个下游信号通路（如MAPK通路）来激活T细胞。有趣的是，跨膜磷酸酶CD45可以使TCR的磷酸化胞质结构域发生去磷酸化，从而抑制T细胞的激活。CD45和Lck之间对立功能平衡的潜在调节机制尚不清楚。LLPS的最新进展表明，在SH3和SH2结构域与其同源基序发生多价结合的驱动下，T细胞受体（TCR）的信号簇可以相分离成凝聚物。此外，TCR信号转导抑制因子CD45则被排除在凝聚体之外，以确保T细胞的活化。总的来说，LLPS不仅为理解复杂的免疫反应提供了一个可行的新框架，而且还通过调节这些免疫反应凝聚体的形成，为治疗干预提供了潜在的新途径。突触是两个神经元产生物理连接和沟通的部位，它们是大脑神经网络的最基本单位。每个突触由数千种蛋白质组成，并且可以响应各种刺激而改变其组成和信号处理能力。因此，突触是种动态的微计算设备。最近的研究还发现，LLPS介导了突触前和突触后致密信号部件的形成。
Zeng等人首次发现突触后致密物（postsynaptic density，PSD）可能是由PSD-95和SynGAP之间的相互作用通过相分离形成。SynGAP和PSD-95是两中含量非常丰富的蛋白，在PSD中以接近的化学计量比存在。PSD-95及其两个同源物PSD-93和SAP102是PSD的核心支架蛋白，可协调多个信号级联，并塑造PSD的基本结构。SynGAP可催化小G蛋白（如Ras和RAP）从GTP结合形式转化为GDP结合形式，而作为突触活动的抑制因子。SynGAP可形成一个平行的卷曲螺旋三聚体，且能够与多个PSD-95结合。无论是在体外还是在活细胞中，这种SynGAP/PSD-95的多价相互作用都可形成LLPS。重要的是，SynGAP/PSD-95凝聚物的形成对于SynGAP在PSD中的稳定和防止神经元过度兴奋有着至关重要的作用。此外，通过使用重组型PSD系统，他们发现跨膜AMPAR调节蛋白（TARPs，AMPARs的辅助亚单位家族，对突触中离子通道的转运和传输至关重要）可通过相分离在PSD凝聚物中聚集。重要的是，TARP C端尾部富含Arg基序的电荷中和性突变会减弱TARP与PSD-95的凝聚，并抑制TARP介导的AMPAR在小鼠海马神经元中的突触传递。因此，LLPS介导的PSD部件形成和调节与突触的生理功能有关。除了PSD信号组件，LLPS在突触前致密信号组件中也起着关键作用。Wu等人最近发现，RIM和RIM-BP（RIM和RIM-BP是突触前致密蛋白中的支架蛋白）之间的多价相互作用促进了RIM/RIM-BP凝聚体的形成。重要的是，电压门控Ca2+通道（VGCCs）的胞质尾部可以通过Ca2+通道尾部与RIM和RIM-BP发生直接结合而被招募到RIM/RIM-BP凝聚物中，从而导致通道的大量富集。这与快速准确释放神经递质的概念是一致的，而这种释放需要两个特征来支持，即突触前质膜上成簇状VGCC的密度，在突触小泡（SV）融合位点所聚集的VGCC与钙传感蛋白接近，这两个特点都可支持神经递质的快速和准确释放。此外，Milovanovic等人表明，突触素作为一种丰富的突触囊泡相关蛋白，可通过LLPS组织囊泡簇而产生。而且，它对维持储备池SV的稳定性很重要，并可能为这些囊泡在动作电位到来时被运送到释放部位做准备。在生理条件下，LLPS确实对广泛的生物过程和系统至关重要。然而，越来越多可以在生理条件下发生LLPS的蛋白也被发现在病理性聚集物中。这些结果表明，病理性蛋白的聚集源于异常的相分离。值得注意的是，蛋白质聚集是多种神经退行性疾病的主要标志，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆症（FTD）、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）、FUS蛋白、tau和α-synuclein表现出可以从可逆的动态性LLPS转变为不可逆的聚集状态，并且分别在ALS、FTD、AD和PD患者受影响神经元中发现了这些蛋白的聚集。这些过程可由疾病相关的突变和翻译后修饰（PTMs）所调节。在本文中，我们回顾了这四个神经退行性疾病相关蛋白中LLPS的固有驱动因素和调节因子（疾病相关的突变和PTMs）（图7）。
TDP-43的LLPS是由IDR中的芳香族、偶极性和带正电的（精氨酸）残基以及暂时形成的a螺旋所介导的。螺旋中的大多数ALS相关突变会降低LLPS，但A321V是一个罕见的例外，它可以增强LLPS。NTD介导的寡聚化有助于TDP-43发生LLPS，而破坏了寡聚化的S48磷酸化模拟物（mimic）则会降低LLPS。富含精氨酸/甘氨酸（RGG）基序中的精氨酸（带正电）与FUS的IDR区中的酪氨酸（芳香族）之间的相互作用与凝聚物的形成有关。FUS序列上多个位置的磷酸化和甲基化可降低LLPS。α-突触核蛋白的LLPS是由两个亲N端结构域中的静电相互作用和AD斑块（plaque）域（NAC）的非Ab成分之间的疏水相互作用所驱动的。与PD相关的突变（E46K, A53T）以及S129的磷酸化都会增加LLPS。Tau的LLPS是由蛋白带负电的N端和带正电的C端区域之间的静电相互作用所驱动的。磷酸化（S199, S202）和P301L突变都已被证明可增加LLPS，而不同结构域的乙酰化与LLPS的降低有关。不同的突变是如何影响蛋白的相分离，关于这一点目前还没有理解透彻。然而，较低饱和浓度的突变有可能会将蛋白质捕获在凝聚系统中，有利于随着时间的推移从可逆的动态LLPS过渡到不可逆的聚集状态。此外，突变可能会改变与细胞LLPS调节剂（modulators）的结合。例如，FUS突变会间接性地抑制其生理性LLPS行为，并通过阻止与其核输入受体转运蛋白1（TRN1）的相互作用来促进聚集，而TRN1在体外和体内均具有伴侣（chaperone）/解聚酶（disaggregase）的活性。至于不同PTMs对相分离的调节作用，一些PTMs可能会通过抑制相同残基上的生理调节性PTMs而触发异常转换，而这些残基在生理条件下会抑制或维持LLPS。因此，我们有必要对这些PTMs在生理和病理性LLPS中的调节作用和功能进行更多的研究，以开发新的治疗策略。癌症被认为是一种基因突变或基因转录失调的疾病。通常情况下，原癌基因的突变会导致基因产物增加或产物的活性增加，从而导致细胞过度增殖形成肿瘤。同样地，突变的抑癌蛋白可能其生物活性会降低，这也会促进肿瘤的形成。尽管近年来在发现原癌基因和抑癌基因中可能会导致癌症的特异性突变方面取得了显著的进展，但我们仍未完全了解这些突变导致癌症的具体机制。LLPS的最新进展可能为理解突变和癌症之间的关系提供了新的框架。
斑点型POZ蛋白（SPOP）是一种肿瘤抑制蛋白，其突变可导致许多实体瘤的形成，包括前列腺癌、胃癌和结直肠癌。SPOP的功能是作为cullin3-RING泛素连接酶的底物接头蛋白（adaptor），可通过泛素-蛋白体系统促进其底物降解。SPOP的底物是各种原癌蛋白，如雄激素受体和死亡域相关蛋白。这些蛋白的积累可以使一些敏感的细胞类型发生癌变。最近的一项研究发现，这些底物可以与SPOP相分离，在体外形成凝聚物，并在细胞中与液态的核细胞器发生共定位。SPOP凝聚物可促进其底物泛素化。SPOP由一个与底物结合的meprin、一个TRAF同源（MATH）结构域和两个二聚体结构域BTB和BACK组成（图8a）。两个二聚体结构域的自结合以及MATH结构域和底物之间的多价相互作用是SPOP相分离的必要条件。此外，MATH结构域的癌症相关突变可通过阻止底物和SPOP之间的相互作用而破坏SPOP凝聚物的形成。致癌性SPOP底物蛋白的积累会导致癌症。同样，突变型SHP2（这是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶）可以招募和激活LLPS中的野生型SHP2，并促进MAPK的激活，从而促进肿瘤的发生。除了SPOP和SHP2，AKAP95，这种核蛋白也可通过剪接调节来支持肿瘤的发生过程并起到重要作用，也可形成相分离的液体状凝聚物。研究发现，关键的残基突变为不同的氨基酸后，会以相反的方向扰乱AKAP95的凝集。重要的是，AKAP95在剪接调控中的活性会因为凝集的破坏而被抑制（abolished），活性会因凝聚物的硬化而明显受损，并可通过使用不相关蛋白的其他凝集介导区替代其凝结介导区而恢复活性。此外，AKAP95调节基因表达和支持肿瘤发生的能力需要AKAP95形成具有适当流动性和动态性的凝聚物。这些结果可将相分离与肿瘤的发生联系起来，并可能会为癌症的治疗性干预提供机会。除了基因突变，转录失调是癌症的另一个标志。如上所述，转录共激活因子在通过LLPS来调节转录方面发挥着重要作用。事实上，目前已经发现了多种可调节肿瘤发生的转录共激活因子会发生LLPS，如Hippo通路的下游效应因子、转录共激活因子YAP和TAZ。YAP和TAZ可以激活各种基因的转录，来调节细胞增殖、器官大小和肿瘤发生。在正常细胞中，各种信号，如高渗性压力、细胞间接触和细胞极性，都可以激活Hippo途径以抑制YAP和TAZ，从而抑制这些基因的转录。然而，Hippo信号通路在许多癌症中是失活的。因此，TAZ和YAP的积累促进了肿瘤的发生和生长。除了这些功能外，YAP和TAZ也有相似的结构。它们都含有WW结构域（YAP有两个WW结构域；TAZ有一个WW结构域）、一个TEAD结合（TB）结构域、一个卷曲螺旋（CC）结构域和一个转录激活（TA）结构域。最近的研究发现，LLPS可介导YAP/TAZ诱导的转录激活。在癌细胞中，YAP和TAZ凝聚物参与促进细胞增殖和对anti-PD-1免疫疗法的抗性。此外，YAP凝聚物在可及的染色质结构域中富集，并可组织形成超级增强子，而TAZ凝聚体中含有DNA结合的辅助因子TEAD4、共激活因子BRD4和MED1以及CDK9。此外，固有的无序TA和CC结构域对YAP凝聚体的形成也非常重要，而CC和WW结构域对TAZ的相分离至关重要（图8b）。而Hippo信号则可通过LATS介导的磷酸化对核YAP和TAZ凝聚体的形成进行负向调节。LLPS的出现为靶向难治性和无成药性的蛋白提供了新途径，例如，最近有报道称，疾病相关的SHP2突变体的LLPS可以被SHP2异构（allosteric）抑制剂特异性减弱。此外，癌症相关的SRC-1（一种核激素受体转录共激活因子）的LLPS可以通过使用抗HIV药物elvitegravir（EVG）而被选择性地破坏。抑制这种异常凝聚物形成的药物将是治疗癌症的潜在新方法。感染性疾病不仅是人类最常见的疾病之一，也是造成人类死亡的主要疾病之一。引起感染的病原体主要包括寄生虫（如锥虫、疟原虫和弓形虫）和其他致病微生物（包括各种病毒、细菌、真菌和支原体）。为了消除病原体感染，人类进化出了非常高效和具有广泛适应性的免疫系统。然而，病原体在其进化过程中也形成了各种免疫逃逸机制。在过去的几十年里，尽管我们对病原体感染和人类抗感染免疫反应之间关系的理解有了显著的进展，但我们对这些复杂过程的具体机制仍然知之甚少。最近，有新的证据表明LLPS参与了病毒性疾病和抗病毒感染的免疫反应。因此，LLPS可能能够提供新的框架来解释和理解传染病的基本机制，并创造潜在的治疗新途径。
SARS-CoV-2作为一种新型冠状病毒，导致了2019年冠状病毒病的全球大流行。在中国发现首例病例后，科学家们已经进行了许多研究，使人们对这种新型病毒有了更深的了解。病毒在侵入宿主细胞后，~30kb的阳性单链RNA基因组被释放出来以进行病毒基因组复制，并翻译出各种蛋白质，包括非结构蛋白和结构蛋白。SARS-CoV-2中主要有四种结构蛋白，包括膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）、核衣壳蛋白（N）和刺突蛋白（S）。其中，N蛋白参与病毒基因组的转录、复制和包装。新出现的证据还显示，N蛋白是通过LLPS机制来执行这些功能。N蛋白在人类体温下能与RNA相分离形成凝聚物，并可被Zn离子增强。N蛋白从N端到C端共由五个部分所组成，包括N端固有（intrinsically）无序区（N-IDR）、结构化N端结构域（NTD）、中央固有无序区（中央IDR）、结构化C端结构域（CTD）和C端固有无序区（C-IDR）（图9a）。其中，NTD和中央IDR在N蛋白与RNA的相分离中起着重要的作用。此外，中央IDR还包含有一个保守的富含丝氨酸-精氨酸（SR）的序列。未修饰的N蛋白会形成凝胶状的凝聚物，并含有离散的核糖核蛋白（RNP），这也有利于发挥其对基因组的包装作用。SR区被CDK1和GSK3磷酸化后，N蛋白会形成用于病毒基因组加工的液体状凝聚物（图9b）。因此，SR区的磷酸化可通过将N蛋白凝聚物的物质特性从凝胶状转变为液体状，以调节N蛋白在基因组包装和加工中的不同功能。除了磷酸化，特定基因组区域的病毒RNA序列和结构也会参与N蛋白相分离的调节。Christiane等人的最新研究表明，病毒RNA基因组的特定区域，包括5᾽末端两边（spanning）（前1000 nt）的区域和编码N蛋白3᾽末端的区域都可促进N蛋白的相分离，而基因组中的大多数其他区域则有利于N蛋白凝聚物的溶解（图9b）。病毒RNA基因组中可促进相分离和溶解的区域之间的平衡可能有利于N蛋白包装病毒基因组。除RNA外，跨膜M蛋白也能独立地与N蛋白形成凝聚物（图9b）。M蛋白的可溶性CTD和N蛋白的C-IDR之间的相互作用介导了这一过程。有趣的是，当把RNA加入到由M蛋白和N蛋白形成的凝聚物中时，会形成两层凝聚物，中央的核心是N蛋白+RNA，周围则是N蛋白+M蛋白的外壳。以上这些结果表明，在SARS-CoV-2感染的后期，病毒RNP凝聚物将与M蛋白的可溶性CTD相互作用，形成双层凝聚物，从而促进SARS-CoV-2病毒的组装。新出现的证据表明，除了SARS-CoV-2之外，许多病毒都可以通过LLPS形成病毒复制凝聚物。总的来说，这些研究为理解病毒在宿主细胞中的复制机制提供了新的框架，并可能有助于开发抗病毒药物。在过去的十年中，LLPS已逐渐成为一个颇具吸引力的研究领域。尽管也取得了一些突破，但我们对LLPS的理解仍然处于起步阶段。越来越多的问题也已经出现。例如，对生物分子凝聚物材料特性的调控中，其基本机制是什么？与疾病相关的突变或PTMs如何调节凝聚物的物理特性？还有，如何调控LLPS以达到预期的治疗效果，这些仍然需要进一步探索。重要的是，需要开发更多的定量工具或方法，并将其应用于LLPS研究。FRAP虽然已被广泛用于证明液相分离的过程。然而必须指出的是，在不同的研究中，同一分子的FARP循环时间速率可以从不到一分钟到数分钟不等，这表明FARP并不是确认LLPS的金标准。此外，在许多研究文章所引用的无细胞重组实验中，分子相分离的条件与生理条件有很大的偏差，包括高盐浓度、高或低pH的缓冲液和高蛋白质浓度。因此，体外实验的结论与细胞中真正的相分离条件或功能可能并不一致。总的来说，尽管LLPS领域还很年轻，而且发展迅速，但这一机制无疑还是彻底改变了我们对各种生物活动和疾病状况的认识。可以预见，关于LLPS和人类疾病的基础研究将不断获得完善并转化到临床实践中去。
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