|
解螺旋公众号·陪伴你科研的第2826天 在众多医生眼中高分论文不是梦想就能成真，那都是遥不可及的存在。不要做梦，放弃幻想，老老实实多发几篇低分文章才是正道。但高分论文真的有那么难吗？并没有你想象中的那么难。
当然，这不意味着你可以一口吃成个大胖子，从一开始就设定一个我要发8分、我要发10分目标。这个大目标当然是难以实现的，从各个方面来说。首先，这样的一个大课题十有八九是申请不下来的。就算成功申请了下来，它的工作量也是几乎不可能完成的。但是，由小课题开始，通过不断加入相关的小课题，从而实现研究的一步步进行推进，最终完成发高分论文的目标是现实可行的。 要知道随着废除“唯论文”的不断深入，论文的质量将在审查中越来越重于数量。靠数量取胜，将不再是可取之道。今天与大家分享的这篇文章是一个很好的模板，帮助大家对比自己已有的研究，发现自己要文章升级还可以做些什么。 当体内的癌细胞呈失控性分裂生长时，人体的免疫T细胞会发生活化,表达与肿瘤细胞表面PD-L1结合的PD-1分子,抑制T淋巴细胞的抗肿瘤免疫反应。于是便有了以下两种抗体：一种是可与T细胞表面的PD-1结合，另一种抗体可与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，两种方法通过分别阻止PD-1与PD-L1结合，使T细胞免受癌细胞的蛊惑，在不伤害正常细胞的同时，消灭癌细胞。以上也就是PD-1/PD-L1免疫疗法。2021月7，中国医生陈宽冰和杨伟在学科分区为一区的Nature子刊Cell Death and Disease杂志上，发表了 “miR-526b-3p inhibits lung cancer cisplatin-resistance and metastasis by inhibiting STAT3-promoted PD-L1”一文，通过应用PD-1/PD-L1免疫疗法，降低了肺癌对顺铂的耐药和转移。该杂志一直是细胞生物学领域的常青树，影响因子由2019年的5.959提高为2020的6.304， 2021年更进一步攀升为8.469。值得一提的是，该文章于2021年3月首次在Cell Death and Disease杂志投稿，2021年7月就见刊发表。很明显这篇文章未曾经过工程浩大的大修就见刊发表，研究的创新性和完整性不言而喻。尽管化疗仍然是晚期肺癌的主要治疗方法，但作为一线治疗的同时，顺铂却常常因频繁发生的耐药性而在应用过程中受到制约。越来越多的证据表明，程序性细胞死亡蛋白配体1 (PD-L1)在调节顺铂耐药性中起着至关重要的作用，然而其潜在的机制还尚未完全明确。为此，他们试图通过分析临床样本，对顺铂敏感的肺癌患者与对顺铂耐药的肺癌患者进行基因筛查，寻找癌细胞对化疗药物耐受的原因及机制，并引入可提高免疫联合化疗抗肿瘤效果方法，希望通过干预此耐受现象增加癌症的治愈率和患者的生存率。人们之前对顺铂应用过程中发生的副作用和耐药性研究时发现，STAT3、MEK1和AKT等信号分子经常处于失调状态，因此，众多研究者曾试图通过调控过度活跃的基因以降低顺铂的耐药性，然而，顺铂耐药肺癌的临床疗效并不令人满意。miRNA在恶性肿瘤中常作为癌基因或抑癌基因发挥作用，但由于一个miRNA可针对不同的mRNA，而多种miRNA又可调控单个mRNA，因此通过miRNA调控顺铂的耐药性，尚需要经过系统筛查，从而确定参与调控顺铂耐药性的最佳miRNA。PD-L1作为PD-1的配体，在恶性细胞中的表达普遍增加，前期研究也发现，多种信号通路可通过与PD-L1融合，调控肺癌对顺铂的耐药性。因此，通过miRNA和PD-L1介导的顺铂耐药性研究，为研究者针对难治性肺癌的治疗提供了新的理论基础和认知。本论文作者基于以上的研究和认识，首先选取了100名接受过化疗的非小细胞肺癌患者，其中男性患者为67人，女性患者33人，并对他们的年龄、淋巴结转移情况、癌症分期、对顺铂的敏感情况和miR-526的表达情况进行了统计，发现患者miR-526的表达水平在不同性别和年龄之间无显著统计学差异；但在淋巴结发生转移、癌症Ⅲ期和对顺铂耐药的患者中， miR-526的表达水平则呈现显著下降趋势。为了深入探讨miRNAs在顺铂耐药肺癌患者中的差异表达，作者选取了三个对顺铂耐药和三个对顺铂敏感的肿瘤标本进行了miRNA阵列研究。实验结果显示，miR-526b-3p在顺铂耐药标本中显著下降，基于此结果，研究者进一步对所有50例顺铂耐药病例进行肿瘤标本和肺癌细胞系的qRT-PCR测定分析，发现miR-526b-3p水平均显著下降。由于miR526b-3p的表达在A549和PC-9细胞系中没有发现显著差异，因此在接下来的体外实验中选择上述两种细胞作为实验模型。当细胞中转染miR-526b-3p的模拟物后，miR-526b-3p表达增加；而在转染miR-526b-3p抑制剂的细胞中，miR-526b-3p表达降低，表明此实验方法可应用于后续的定向实验。接下来，作者将miR526b-3p模拟物引入顺铂耐药的细胞，随后暴露于顺铂环境中，发现miR-526b-3p组对抗顺铂的半数抑制浓度（IC50）IC50值降低。此外，通过MTT测定法分析发现miR-526B-3P能够抑制细胞活力的异位表达，而miR-526B-3P抑制剂促进了细胞活力。作者通过Transwell测定法测定所指示的细胞迁移情况也发现miR-526b-3p的过表达可抑制细胞迁移，而miR-526b-3p敲除则增强细胞迁移。以上结果充分表明miR-526b-3p在顺铂耐药的肺癌中是可充当肿瘤抑制因子。
为了找到miR526b-3p的下游靶点，作者使用miRDB数据库进行了精准预测，发现信号转导子和转录激活子3 (STAT3)在数百个候选基因中表达上调最明显，因此，作者选择了STAT3进行下一步研究。miR-526b-3p与STAT3 3’UTR之间结合位点的示意图如下图所示。利用免疫组织化学染色和qRT-PCR方法对STAT3在肺癌中的表达进行分析时发现，STAT3在顺铂耐药肺癌中的表达高于顺铂敏感的标本，且STAT3表达与miR-526b-3p呈负相关。该结果表明，STAT3为miR-526b-3p的靶点之一，在顺铂耐药肺癌中的表达增加现象可被miR-526b-3p明显抑制。
miR-526b-3p/STAT3复合物可调控肺癌 接下来，作者为了进一步探讨miR-526b-3p/STAT3复合物对肺癌恶性程度的调控作用，特将miR-526b-3p/STAT3复合物导入细胞。结果显示，当细胞内转染miR-526b-3p基因后，STAT3表达下降，而在联合转染的细胞中，STAT3的表达却增强了。通过罗丹明123外排法检测多耐药基因1（MDR1）活性时，发现miR-526b-3p组罗丹明123的相对荧光单位减少，而组合中的相对荧光单位升高，表明STAT3的异位表达逆转了miR-526b-3p在药物外排中的抑制作用，STAT3过表达还可减弱miR-526b-3p对细胞生长的抑制作用。不仅如此，miR-526b-3p还可以抑制PD-L1的表达，而与STAT3的复合物则促进PD-L1的表达。那么PD-L1的表达在癌细胞的生长繁殖过程中发挥着怎样的作用呢？作者查阅文献得知，PD-1/PD-L1相互作用可通过抑制CD8+T细胞来增强肿瘤的免疫逃逸，于是他们将miR-526b-3p引入细胞，发现miR-526b-3p触发了CD8+T细胞的数量，而STAT3则阻断了这一促进作用。
PD-L1, miR-526b-3p/STAT3与顺铂耐药性 作者根据前人的实验结果了解到，STAT3可通过促进PD-L1表达，增加乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的化疗耐药性，那么miR-526b-3p对STAT3和PD-L1的表达又发挥着怎样的呢？通过实验结果发现，敲除miR-526b-3p可促进STAT3和PD-L1的表达，而可显著抑制PD-L1的靶向单克隆抗体Avelumab，对STAT3和miR-526b-3p的表达几乎没有影响。通过测定MDR1的活性时发现，avelumab抑制了miR-526b-3p抑制剂在药物流出中的作用，且miR526b-3p抑制剂组的CD8+ T细胞数量下降，miR-526b-3p抑制剂还显著增强了细胞迁移。以上实验结果表明，miR-526b-3p/STAT3复合物以PD-L1依赖的方式调节顺铂耐药性。
PD-L1, miR-526b-3p/STAT3与癌转移 最后，作者利用苏木精和伊红染色的肺转移图像证实了，miR526b-3p可降低PD-L1的表达，通过免疫印迹实验还发现癌基因c-Myc和多药耐药调节因子MDR1在miR-526b-3p组降低，以上实验结果表明，在动物模型中获得的观察结果与体外细胞实验获得的结果一致，这也充分证实了miR-526b-3p/STAT3信号通路可调节体内的癌症转移。本实验发现，miR-526b-3p可靶向抑制STAT3，并以PD-L1依赖的方式抑制癌细胞生长、迁移和对顺铂耐药性，期望在未来再进行多次实验论证后，争取将基因筛查体内miR-526b-3p水平作为一种新的检测靶标，并将调控miR-526b-3p基因水平和介导PD-L1等手段，作为新的治疗方式，以此增加肺癌患者对顺铂的敏感性，提升治疗效率、提高生存率。PD-1/PDL1抑制剂免疫治疗在临床肿瘤治疗中还有哪些应用呢？帕博丽珠单抗是临床一线的PD-1抑制剂，也是一种高选择性的人源化单克隆抗体，其作用机制是结合PD-1受体以防止PD-1与PD-L1相互作用，刺激抗肿瘤免疫反应。纳武利尤单抗也是PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。其在非小细胞肺癌的治疗中，其他抗PD-1药物(如多西他赛)相比，总生存率可显著延长，并且显示出较轻的不良反应。阿替唑珠单抗是抗PD-L1抗体，临床上主要应用于肾癌和非小细胞肺癌的治疗，在死亡率和不良反应方面均优于多西他赛。研究显示，阿替唑珠单抗能明显改善肿瘤浸润淋巴细胞中干扰素-γ的表达，提高PD-L1阳性肿瘤患者的总生存率。伊匹单抗是一种抗CTLA4抗体，已成为治疗转移性黑色素瘤、前列腺癌和小细胞肺癌的标准药物，并提高整体生存率。在PD-L1阴性患者中，尼沃玛联合伊匹单抗的联合治疗显示出比单一治疗更高的进行性自由生存优势，而PD-L1阳性患者对此不敏感。(1) 一线和二线PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗可增加患者耐受性，降低毒性。(2) 结合两种以上的检查点单克隆抗体，如伊匹单抗/纳武利尤单抗，既可提高疗效又可降低毒性，患者联合治疗的总生存率可达到58%。(3) PD-1/PD-L1单克隆抗体联合肿瘤疫苗也为黑色素瘤治疗提供了新的前景：同时接受尼沃玛和肿瘤疫苗的患者的中位无复发生存期为47.1个月，总生存率达到80%以上。(4) 重定向的T细胞(CAR-T)加PD-1阻断将有利于肿瘤治疗，并具有长期持久性和有限的免疫逃逸。(5) 吲哚胺2，3-双加氧酶1 (IDO1)参与色氨酸分解代谢，促进免疫抑制微环境，其与PD-1/PD-L1的双重抑制在抗肿瘤监测和预后中起着至关重要的作用。(6) PD-1/PDL1的小分子抑制剂与PD-1/PD-L1结合，可呈现出可变的结构和更好的肿瘤浸润能力。(7) MPDL-3280A作为是一种工程化的人源化抗PD-L1 IgG1单克隆抗体，可适用于PD-1/PD-L1+肿瘤治疗。(8) PD-1/PD-L1作为一个重要的免疫检查点，可通过PI3K/Akt/ mTOR和MAPK信号网络进行调控；NF-κB、HIF、PTEN、p53、CDK5、BRD4、STAT等转录因子也是影响PD-1/PD-L1表达的关键因素；表观遗传和翻译后修饰也参与PD-1/PD-L1调控，以上这些信号都可以作为潜在的目标进行干预和治疗。
|
