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1 MSI和MMR的定义 微卫星( microsatellite，MS) 是指细胞基因组中以少数几个核苷酸(多为1 ~6个) 为单位串联重复的DNA 序列，又称短串联重复(STR) 。MSI 分成3 类: 微卫星高度不稳定性(MSI-H) 、微卫星低度不稳定性(MSI-L) 、微卫星稳定(MSS) [1]。 人类细胞DNA在复制过程中可能整合错误的核苷酸，但随即会被选择性地从新生DNA 链中移除，从而防止子代细胞出现基因突变，这种机理称为错配修复MMR。MMR的产物是错配修复蛋白，如MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2等。他们形成异质二聚体，识别错配碱基和不匹配DNA环（IDLs），准确定位于细胞核，体现其错配修复功能。
图1 错配修复功能复合体示意图 错配修复蛋白家族具有一些基本特征，由两个错配修复功能的复合体构成。MLH1（红）和PMS2（蓝）是一个复合体；MSH2（红）和MSH6（蓝）是一个复合体，其中MLH1和MSH2是两个复合体内的主要功能蛋白。复合体内主要蛋白的降解往往伴随着各自复合体内其他蛋白的共同丢失。MSH6与MSH3之间存在功能冗余，有时MSH6的功能会被MSH3代偿掉。在变异类型上，MSH2多发生剪切突变，导致蛋白水平的丢失。而MLH1的启动子容易发生超甲基化，同时伴有点突变发生。 2 MSI/MMR的临床意义 MSI 是MMR 蛋白功能缺陷导致的结果。MMR蛋白功能缺陷同时也会导致基因组呈现高突变表型，进而导致肿瘤发生风险增加。目前，MSI和(或) MMR蛋白检测被美国国立综合癌症网络(NCCN) 结直肠癌临床实践指南及中国临床肿瘤学会(CSCO) 结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结肠直肠癌(CRC) 患者[2-4]。MSI 检测对于包括CRC 和子宫内膜癌(EC) 在内的多种实体瘤患者均具有重要临床意义。 林奇综合征主要由MMR 基因( MLH1、MSH2、MSH6 或PMS2) 之一发生杂合性致病性胚系突变所致，或由EPCAM 基因缺失导致MSH2 不表达所致[5]。由于MMR 基因的功能失活性改变，林奇综合征患者往往表现错配修复功能缺陷(dMMR) 和(或)MSI-H 表型。 需要注意的是，以MMR 蛋白/MSI 检测作为初筛手段，有可能漏诊部分林奇综合征患者。MMR 蛋白表达及MSI (基于不同的微卫星位点选择的DNA检测) 对林奇综合征的检测敏感度分别为83% 和77% ～ 89%，提示即使对所有CRC 患者进行MMR或MSI 普筛，也可能存在高达10% 的漏诊率[6]。 目前公认dMMR/MSI-H 是Ⅱ期CRC 的独立良好预后因子，对于具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ期CRC 患者，3/4 级分化(低分化) 不被认为是高危因素[7]。与MSS患者相比，MSI-H患者死亡风险降低35% [4]。 一项基于多个Ⅲ期临床研究入组患者数据( n = 570) 的回顾性分析表明，Ⅱ/Ⅲ期CRC 患者存在MSI-H 可预测其接受5-FU 单药辅助化疗无效[8]。一项meta 分析亦显示，具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ/Ⅲ期CRC 患者不能从5-FU 单药辅助化疗获益，且Ⅱ期dMMR/MSI-H 患者接受5-FU 单药辅助化疗生存期反而缩短( HR = 2. 95; 95% CI: 1. 02～ 8. 54) [9]。这些数据表明，对于具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ期CRC 患者，给予5-FU 单药辅助化疗非但不能生存获益，反而对长期生存产生不利影响。
(A) 未经治疗的不同MMR表型CRC患者的生存期(B) 经治疗的不同MMR表型CRC患者的生存期. 图2 dMMR/MSI-H Ⅱ/Ⅲ期CRC患者接受5-FU 单药辅助化疗生存期 因此，Ⅱ期CRC 患者根治术后是否应接受辅助化疗以及应接受何种药物或方案进行化疗，需要综合考虑临床-病理高危因素以及MSI 状态。国内外权威指南均明确提出，具有dMMR/MSI-H 表型的Ⅱ期CRC 患者预后较好，不建议使用氟尿嘧啶类单药辅助治疗[2-4]。 3 MSI和MMR的检测方法及其对比 3.1 IHC 法检测MMR 蛋白 IHC 方法采用分别针对MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 的特异性抗体，阳性表达定位于细胞核。如肿瘤样本中4 个MMR 蛋白均阳性表达，则为错配修复功能完整 (pMMR) ; 任一MMR 蛋白缺失即为dMMR[11]。 3.2 多重荧光PCR毛细管电泳法 直接检测MSI 状态的常用方法是多重荧光PCR 毛细管电泳法，这也是当前公认的MSI 检测“金标准”。《CSCO 结直肠癌诊疗指南2020 版》建议采用NCI 推荐的5 个MS 位点( BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346 和D17S250 ) 进行MSI 检测[4]。《NCCN遗传/家族高危评估指南:结直肠癌》建议MSI检测Panel可选择NCI/Bethesda版，也可选择Promega版： BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27和2个五核苷酸位点(用于标本鉴定) [12]。 3.3 二代测序(NGS ) 近年来，随着高通量测序平台的广泛应用，NGS平台目标区域测序(即NGS panel) 或全外显子组测序(WES) /全基因组测序(WGS) 开始应用于MSI检测。NCCN 结直肠癌临床实践指南指出，MSI 检测可通过经验证的NGS panel 进行，尤其是对于那些需要同时检测RAS /BRAF 突变状态的转移性CRC 患者[2-3]。 此外，基于外周血循环肿瘤DNA (ctDNA) 的MSI(b-MSI) -NGS 算法亦已崭露头角，为肿瘤组织取样困难或不足的晚期实体瘤患者MSI 检测提供新选择。由于血检NGS panel 及其各自b-MSI-NGS 算法数据尚未在学术期刊上发表，因此，b-MSI-NGS 检测在当前不应常规推荐，仅作为缺乏组织的患者为明确MSI 状态的一种替代手段。 3.4 不同检测方法的比较 表1 不同检测方法学比较
注: MMR: 错配修复; MSI: 微卫星不稳定; b-MSI: 基于外周血循环肿瘤DNA 的MSI; IHC: 免疫组织化学; NGS: 二代测序; ctDNA: 外周血循环肿瘤DNA ; AFmax: 最大等位基因频率; TMB: 肿瘤突变负荷 IHC、PCR与NGS 三种方法各有优缺点。IHC 法可以直接鉴定出导致MSI-H 发生的MMR 缺陷基因。IHC 法检测MMR 蛋白表达可在多数医院的病理科完成，普及性强，且价格低廉。但该方法受判读人员的主观影响较大，存在一定的假阳性与假阴性。基于样本微切割的多重荧光PCR 毛细管电泳法，简便且便宜，敏感度和特异度均较好(特别是在经广泛验证的CRC 肿瘤样本中)，但全国能开展该项检测的病理科相对较少，且存在一定的假阴性。对于需要同时检测肿瘤驱动基因和(或) 治疗相关基因变异的患者，目标区域NGS 是个不错的选择。NGS 法可同时检测panel 覆盖的驱动基因变异，包括MMR 基因胚系和(或) 体细胞突变，甚至TMB 等分子标签。基于ctDNA 样本的b-MSI 检测目前正处于验证阶段，有望为肿瘤组织取样困难或不足的晚期肿瘤患者提供新的选择。但NGS 单独用于MSI 检测则不推荐，理由是增加经济负担和浪费资源。 4 MSI和MMR的相关性 一般而言，dMMR 相当于MSI-H 表型，pMMR 相当于MSI-L /MSS 表型。大量的临床试验证实，分子水平的MSI检测与蛋白水平MMR检测具有高度关联性，其中在结直肠癌两者的一致性约为92%，在子宫内膜癌两者的一致性是高达94%[12-14]。
图3 MSI与MMR检测具有高度关联性 然而，在实际的临床工作中，大概有5%-10%的患者发生MMR与MSI检测不一致的情况，主要有以下两种类型。 dMMR vs MSS 5%-10%的dMMR患者并未导致MSI的出现，就是dMMR和MSS，其发生的原因可能为： ①某些MMR蛋白的缺失，被功能代偿，如前文所述MSH6蛋白被MSH3蛋白功能代偿。 ②MLH1启动子甲基化导致的肿瘤异质性，从而影响结果判断。 pMMR vs MSI-H 5%-10%的MSI的发生并未伴随dMMR的出现，就是pMMR和MSI-H，其发生的原因可能为： ①某些MMR蛋白发生错义突变，损失了MMR功能，但仍存在相应抗原被抗体检测识别。因此，在检测MMR的过程中，其并未发生缺失，还是可以被检测出，实际上功能已经丧失，而发生MSI的情况。 ②由四种基因以外的其他基因引起的MSI，如POLE/POLD。 对于MSI/MMR双平台检测，两者具有互补作用。在对免疫治疗的提示中，以MSI的检测状态为主要标准。在组织量足够的情况下应使用双平台检测；当双平台检测结果不一致时，并且排除实验因素的情况下，可用NGS平台复检，提供更多确诊信息。   |
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