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2022 年 5 月 29 日是第十八个世界肠道健康日，肠道作为人体重要的消化器官和免疫器官，其健康程度与人体的整体健康息息相关。因此，越来越多的专家呼吁提升公众的肠道健康意识，预防肠道疾病，积极筛查肠道疾病，早诊早治。 近些年，肠道疾病尤其是结直肠癌的发病率在我国呈上升趋势。2022 年 2 月，我国癌症中心发布了最新一期癌症统计数据，其中结直肠癌发病率及病死率都高居前列。结直肠癌发病率的上升不仅与人们生活水平的提高有关，也与肠道筛查的普及密切相关。但是，多数结直肠癌患者早期并无明显的症状，通常因临床症状而就诊被发现时已经是中晚期，那么如何在发现后及时获取与诊疗相关的检测是至关重要的。 目前，在病理科已有多种不同的与治疗或预后相关的靶向标记检测。错配修复蛋白(MMR)/微卫星不稳定性(MSI)检测、BRAF、RAS（NKAS及KRAS）等是中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南的推荐的检测项目[1]。其中 MMR/MSI 检测更是被作为首要检测项目，其意义不仅是为了筛查林奇综合征，更是为了预后分层及指导现在临床治疗中大热的免疫治疗[2]。《结直肠癌分子生物标志物检测专家共识》更是推荐对所有结直肠癌患者进行 MMR 或者 MSI 检测，足见其重要性。  图片来源于2022年CSCO结直肠癌诊疗指南，无论是活检、EMR/ESD标本还是根治标本都建议进行MMR/MSI检测 一、MMR/MSI 的意义 微卫星（也称为“短串联重复序列”）对应分布在整个基因组的 DNA 序列（编码或非编码序列），具有重复结构，即单核苷酸或二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸。在 MMR 系统(dMMR 状态)不稳定的情况下，这些重复的结构容易出现复制错误。这些微卫星序列中错误的积累，被称为微卫星不稳定性，提示 MMR 系统的故障。具有这种表型的癌症被称为 MSI 或 MMR 缺陷(dMMR)相关的肿瘤，这与微卫星稳定性(MSS)相反，MSS也被称为 MMR 稳定(pMMR)[3] 。 MMR 系统由四种主要蛋白组成，即 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2。这些蛋白质可以识别并纠正在DNA复制过程中由 DNA 聚合酶引起的配对错误。这些蛋白两两合作，MLH1 与 PMS2 搭配，MSH2 与 MSH6 搭配，分别形成 MutLα 和 MutSa 复合物，识别和修复碱基对的错误。四种蛋白(MLH1、PMS2、MSH2或MSH6)之一的功能缺失将导致 MMR 系统失活，导致复制保真度的丧失和突变的积累。这种超突变谱会导致 dMMR/MSI 相关肿瘤，包括 dMMR/MSI 的结直肠癌[4][5]。 二、MMR 与林奇综合征 林奇（Lynch）综合征是一种常染色体遗传病，由 MMR 基因发生胚系突变所致，占所有结直肠癌患者的 3~5%。携带者本人或者家族成员可发生结直肠癌及其他多种 Lynch 相关的肿瘤，包括子宫内膜癌、卵巢癌、泌尿系统肿瘤、胃癌、小肠癌等，其中结直肠癌和子宫内膜癌最为多见。携带者终身患这两种肿瘤的概率分别为 80%和 20~60%，此类患者通常患病年龄较年轻，早于普通人群[6]。所以应用 MMR/MSI 检测在结直肠癌患者中将这部分病人筛选出来是十分必要的。MMR 功能缺陷或者 MSI-H 的患者提示 Lynch 综合征的可能。  图片来源于《结直肠癌分子生物标志物检测专家共识》 三、MMR 与结直肠癌的 预后分层和治疗相关 2021 年 CSCO 结直肠癌诊疗指南推荐对所有Ⅱ期结直肠癌患者进行 MMR 检测，文中提到 dMMR/MSI-H 的 Ⅱ 期患者可能预后较好，且不会从单药氟尿嘧啶类药物的辅助化疗中获益[1]。《结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识》里也指出 dMMR/MSI-H 的晚期结直肠癌患者可以从 PD-1/PD-L1 的治疗中获益[8]。 2021 年 6 月 15 日， NMPA 批准帕博利珠单抗正式获批用于 KRAS、NRAS 和 BRAF 基因均为野生型，不可切除或转移性高微卫星不稳定性（MSI-H）或错配修复基因缺陷型（dMMR）结直肠癌（CRC）患者的一线治疗；2022 年 3 月 11 日，百济神州公司宣布，替雷利珠单抗（百泽安）获得国家药品监督管理局（NMPA）批准，用于既往经治的局部晚期不可切除或转移性微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）实体瘤患者治疗。 2022 年 3 月 24 日，国家药监局官网信息显示，复宏汉霖创新型 PD-1 药物斯鲁利单抗获批，用于单药治疗经标准治疗失败后、不可切除、转移性高度微卫星不稳定型（MSI-H）实体瘤，这也是国内第七款获批上市的 PD-1 单抗。 四、MMR/MSI 的检测方法 目前用于评价 MMR/MSI 检测的方法主要有免疫组化法（IHC）、多重荧光 PCR 毛细血管电泳法、二代测序法等。 IHC 检测 MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 四种主要的 MMR 蛋白表达情况，可以间接评估MSI状态。任何一个蛋白缺失即为 dMMR，相当于 MSI-H；4 个蛋白均表达则判定为错配修复功能完整（pMMR），相当于 MSI-L/MSS。 PCR 可以直接检测 MSI 肿瘤中的 DNA 的表达情况。2021 年的《NCCN 结直肠癌指南（V2）》、《结直肠癌分子检测高通量测序专家共识》、《CSCO 结直肠癌诊疗指南（2021 版）》推荐的 MSI 检测金标准的方法是 PCR 毛细管电泳法，而选择的位点只有两套，一套是 NCI 的 2B3D Panel（BAT-25、BAT-26、D5S346、D17S250、D2S123），另外一套是 Promega 的 5 个单核苷酸 Panel（通常指 Promega：包括 BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）。 NGS 即二代测序可以对多个微卫星位点、肿瘤突变负荷（TMB）、CRC 相关的其他基因如 BRAF、NAS 及一些胚系基因 APC、PETN 同时检测，且特异性及敏感性较高。对于一些 CRC 晚期想要看免疫治疗靶点的患者，应用 NGS 来检测 MSI 的状态是更高效的[10]。但是由于价格昂贵目前并未做常规推荐。 对于实验室如何安排 MMR 和 MSI 检测，欧洲肿瘤学会（ESMO）有如下推荐： 推荐 A： MSI 检测的第一种方法是 MMR IHC。IHC 方法使用广泛，共检测 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 四种 MMR 蛋白。（强烈推荐）  推荐 B： IHC 结果不确定时应进行 MSI-PCR 检测，包括 IHC 解释不一致或有困难，或仅缺失一个异源二聚体亚基（如仅有 MLH1 或 PMS2 缺失）。传统 PCR 分子检测 MSI 的 2 个组合中，BAT-25、BAT-26 、NR-21、NR-24、NR-27 组合因其敏感性和特异性较高而更多推荐使用。MSI 定义为 5 个微卫星标志中 ≥2 个失去稳定性。  推荐 C： NGS 是另一种评估MSI的方法，其主要优点是 MSI 分析与 TMB 测定可同时进行，而且 NGS 允许同时进行大量微卫星和基因高通量测序，因此有发现其他非免疫治疗靶点的可能。基于 NGS 的 MSI 检测有可能用于所有肿瘤的 MSI 检测，并不仅限于林奇综合症。（强烈推荐）  可见在 MMR/MSI 的检测方法中，免疫组化法检测 dMMR 速度快、容易开展、且性价比高，因此目前在临床实践中广泛应用。在免疫组化检测过程中，规范化的操作和判读、优质抗体的选择等都对结果的准确性起到重要的影响。如：选择在 NordiQC 等国际质控体系中通过率高、表现优异的抗体可以获得更加准确的检测结果。另外， MMR/MSI 的二者的表达受肿瘤异质性、是否新辅助化疗等多种因素影响，二者表达不一致时可采用多种方法检测以进一步指导临床[9]。 参考文献 向上滑动阅览 1. 中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南2021. 2. 结直肠癌分子生物标志物检测专家共识编写组. 结直肠癌分子生物标志物检测专家共识. 中华病理学杂志 2018年4月第4卷第4期. 3. Evrard, C; Tachon, G; Randrian, V; Karayan-Tapon, L; Tougeron, D. Microsatellite Instability: Diagnosis, Heterogeneity, Discordance, and Clinical Impact in Colorectal Cancer. Cancers. 2019, 11, 1567. 4. Kawasoe, Y.; Tsurimoto, T.; Nakagawa, T.; Masukata, H.; Takahashi, T.S. MutSαmaintains the mismatch repair capability by inhibiting PCNA unloading. Elife 2016, 5, e15155. 5. Sinicrope, F.A.; Sargent, D.J. Molecular Pathways: Microsatellite Instability in Colorectal Cancer: Prognostic, Predictive, and Therapeutic Implications. Clin. Cancer Res. 2012, 18, 1506–1512 6. 何建芳、韩安家、吴秋良主编. 实用免疫组化病理诊断. 7. Vasen, H F A; Moslein, G; Alonso, A; Bernstein, I; Bertario, L; Blanco, I; Burn, J; Capella, G; Engel, C; Frayling, I; Friedl, W; Hes, F J; Hodgson, S; Mecklin, J-P; Moller, P; Nagengast, F; Parc, Y; Renkonen-Sinisalo, L; Sampson, J R; Stormorken, A; Wijnen, J. Guidelines for the clinical management of Lynch syndrome (hereditary non-polyposis cancer). J Med Genet.2007 Jun;44(6):353-62. 8. 中国抗癌协会肿瘤靶向治疗专业委员会. 结直肠癌分子检测高通量测序中国专家共识. 临床肿瘤学杂志. 2021年3月第26卷第3期. 9. Guyot D'Asnières De Salins, A; Tachon, G; Cohen, R; Karayan-Tapon, L; Junca, A; Frouin, E; Godet, J; Evrard, C; Randrian, V; Duval, A; Svrcek, M; Lascols, O; Vignot, S; Coulet, F; André, T; Fléjou, JF; Cervera, P; Tougeron, D. Discordance between immunochemistry of mismatch repair proteins and molecular testing of microsatellite instability in colorectal cancer. 2021 Jun;6(3):100120. 10. Xiao J; Li W; Huang Y, Huang M; Li S; Zhai X; Zhao J; Gao C; Xie W; Qin H; Cai S; Bai Y; Lan P; Zou Y. A next-generation sequencing-based strategy combining microsatellite instability and tumor mutation burden for comprehensive molecular diagnosis of advanced colorectal cancer. BMC Cancer. 2021 Mar 16;21(1):282.  |
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