 导语 今天给同学们分享一篇关于非肿瘤单细胞测序的生信分析文章 “ Expression of Immune Related Genes and Possible Regulatory Mechanisms in Alzheimer's Disease ”，这篇文章于2021年11月发表在 Front Immunol 杂志上，影响因子=7.561。本研究作者通过结合单细胞测序RNA（scRNA）联合bulk seq数据的生信分析，研究了IRG在非肿瘤（AD）中的表达特征和可能的调控机制。 1.AD中PBMC的scRNA生信分析 非肿瘤分析竞争相对较少。本研究对GEO数据库中的scRNA测序数据集（GSE181279）进行生信分析，其中包括36849个PBMC，包括来自AD患者的22775个细胞和来自对照组（NC）的14074个细胞。过滤后，保留24679个细胞，包括来自AD患者的14033个细胞和来自NC的10646个细胞。每个样本的生信表达特征如图1A所示。代表唯一分子标识符（UMI）数量的nCount_RNA与代表基因数量的nFeature_RNA正相关，相关系数为0.92（图1B）。确定了前10名HVG（图1C）。S100A8和S100A9是最前面的两种HVG，它们是在炎症条件下高表达的小型钙结合蛋白。PCA识别了所有15个P值<0.05的PC，如JackStrawPlot所示（图1D），使用10个PC识别了8个簇，并列出了每个簇的前10个差异基因（图1E）。  图1 非肿瘤（AD）中PBMC的scRNA生信分析 根据之前的一项研究，这些簇可以通过标记基因分配给已知的细胞谱系。使用t-SNE分析对八个簇进行可视化（图2A）。椭圆标记的NK簇显示AD组NK簇百分比降低（图2B）。单细胞类型标记基因的表达显示在点阵图（图2C）和小提琴图（图2D）所示。图2E显示了每个簇中细胞的比例。与NC组相比，AD组NK细胞簇显著减少，而CD4 T细胞在AD组呈增加趋势（图2F）。  图 2每个簇的标记基因表达 2.AD患者PBMC细胞群的IRG评分及生信特征 为了研究AD患者PBMC的IRG生信表达特征，根据ImmPort数据库筛选每个簇的差异基因以生成IRG，该数据库总结了已发表研究中的IRG，并从外周血单个核细胞中每个簇的差异基因中获得212个IRG。使用AUCell R包测定每个细胞系的IRG活性（图3A）。更多基因的细胞表现出更高的AUC值，这些细胞主要位于NK和DC细胞中，呈黄色（图3B）。由于AD组NK簇显著减少（图2B，F），作者进一步对PBMC NK簇中的差异基因进行GO和KEGG分析。这些基因富集通路主要与抗原处理和免疫反应有关（图3C、D）。  图3 AD患者PBMC细胞群的IRG评分 3.从单细胞生信测序数据中提取AD大脑的差异基因 为了研究AD患者脑组织的生信表达特征，对包括310名AD患者和157名对照者的RNA测序数据集GSE33000进行生信分析，以探索AD患者脑组织中的差异基因，并筛选PBMC和脑组织之间常见的IRG。选择调整后P值<0.05且| logFC |>0.03的差异基因。此后，5339个上调差异基因和5542个下调差异基因被保留在AD大脑中（图4A）。图中显示了top100上调和top100下调差异基因的热图，并观察到组内的相对一致性（图4B）。有趣的是，与AD的PBMC中NK簇的表达特征类似，AD大脑中差异基因的前10个GO富集通路也与免疫反应相关（图4C、D）。这些数据表明，AD PBMC中NK簇的差异基因与AD脑中的差异基因具有相似的GO富集通路，表明NK细胞在AD患者脑中的潜在作用。  图4 AD大脑差异基因 4.常见IRG及生信相关转录调控因子 由于NK细胞簇中差异基因的GO通路和AD脑中差异基因的GO主要富集通路与免疫反应相关，作者进一步研究了NK细胞和AD脑中IRG的共同生信表达特征。在PBMC NK簇和AD脑中共发现70种常见的IRG（图5A）。GSE33000中最常见的40种IRG差异基因的表达主要活跃在PBMC的NK簇中（图5B）。  图5常见IRG和相关调节转录因子 为了研究IRG的转录调节活性，从HumanTFDB获得了1665个TF。AD NK簇中34个TF和AD脑中765个TF被保留。此外，17种常见的TF在AD周边NK簇和AD大脑中均表达（图5C）。FindAllMarkers函数是使用默认参数应用的。在这种情况下，只有超过25%的细胞中表达的阳性基因被选择，logFC截止值为0.25。在所有聚类中，共鉴定出1979个独特的标记基因。对于NK簇，共鉴定出778个标记基因，只有34个基因属于TFs。因此，外周NK标记基因、AD大脑中的差异基因和TF数据库之间的重叠TFs仅为17。显示了GSE33000和AD周边NK簇中17种TF的表达（图5D，E）。13种TF在AD脑中上调，17种TF在NK和NKT细胞中均活跃。PPI网络表明，STAT3可能在IRG转录调控中作为中枢基因发挥关键作用（图5F）。 5.确认NK细胞在AD脑内浸润情况 为了确认NK细胞对组织的浸润。作者从GEO数据库中选择了scRNA测序数据集GSE142853，该数据集对3XTg AD小鼠大脑中分类的NK细胞进行测序。共有3250个细胞，包括来自AD小鼠的1634个细胞和来自NC小鼠的1616个细胞。生成了10个簇（图6A）。第6组的百分比在AD组高于NC组（分别为4.6%和2.9%）（图6B）。The cytotoxic molecule (Cstd), pro-inflammatory chemokines (Ccl3, Ccl4), adhesion molecules (Icam1), NK cell activation molecules (Tbx21, Nfatc1, Nfkbia, and Klra9) 在簇6中高表达（图6C、D）。此外，使用SingleR和Celldex R软件包对这些聚类进行注释，并使用分数计算预测精度。SingleR是一种用于scRNA测序数据的自动注释方法。SingleR提供了一个包含已知单元类型标签的样本的引用表达式数据集，它可以基于与引用的相似性来标记新单元。celldex R软件包提供了一种简单的方法，可以将SingleR软件包应用于scRNA测序数据的注释。得分越高表示预测越准确，NK细胞的得分最高。结果显示，GSE142853中的10个簇中有9个被标注为NK细胞，而一个簇被标注为小胶质细胞。NK和小胶质细胞注释均标记为黄色，代表更高的准确性（图6E）。tSNE图显示3XTg AD小鼠大脑中小胶质细胞和大部分NK细胞的比例非常小（图6F）。综上所述，GSE142853数据集证实了AD大脑中存在NK细胞，并且一些浸润的循环NK细胞在AD大脑中被激活。  图6 AD脑中NK细胞的scRNA分析 小结 综上所述，作者通过结合scRNA和大量测序数据的生信分析进行非肿瘤的机制探讨，提出外周NK细胞可能渗入大脑，并导致AD的神经炎症改变。此外，STAT3可能参与IRG的转录调节、NK细胞的浸润和激活。 |
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