|
正交法优选淫羊藿中总黄酮的提取工艺研究 【摘要】目的： 优选淫羊藿总黄酮的提取工艺, 方法：采用L9(34)正交试验考察浸泡时间(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)、加碱水量(D)四个因素。以芦丁为对照品，用比色法测定淫羊藿总黄酮的含量。结果：淫羊藿总黄酮最佳提取工艺为加15 倍的0.3 % Na2SO3的pH 为9-10 的氢氧化钠碱液，浸泡1h，煎煮2次，每次1.5 h。结论：该实验确定的最佳提取工艺稳定性好且简便易行，适合工业化大生产。 关键词： 淫羊藿；总黄酮；正交试验；提取工艺；抗氧化剂 Study on Extraction and Purification Process of Total Flavonoids from Epimedium by Orthogonal Design 【Abstract】 Objective: To optimize the best extraction process of total flavonoid of her ba epmedii. Methods：The optimal conditions,such as extraction times(A), decoction time(B), decoction times(C),basic water volume(D) were investigated by L9(34) orthogonal design, this flavonoid was determined by colorimetric method. Results:The best artwork of retrieval total flavonoids of epimedium was that added 15 times amount of pH 9--10 sodiumhydroxide which including 0.3 % Na2SO3, soaking 60 minutes and extracting for 90 minutes and extracting for 2 times. Conclusions:The optimized process was stable, feasible, economic and practicality. 【key words】Epimedium sagittatum Maxim; Total flavonoids; Orthogonal experiment ; Artwork of retrieval; Antioxidant 1. 前言： 淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim)为小檗科淫羊藿属植物的地上部份。本草纲目记载,具有补肝肾、强筋骨、助阳益精、祛风湿、抗肿瘤、抗氧化之功效[1-3]。其主要有效成分为淫羊藿总黄酮。传统工艺一般采用醇提, 乙醇成本高。水提法、碱性水提取法提取率较低[4]。淫羊藿中黄酮类化合物大多数为黄酮苷类, 其苷元为8- 异戊烯基奈酚, 其含有酚羟基的结构, 而酚羟基容易氧化为醌式结构。若在其提取过程中加入抗氧化剂, 则能减少其被氧化的机会, 使总黄酮的损失减少。为了充分提取总黄酮, 实验采用正交试验对碱性水提取淫羊藿总黄酮进行了研究。 2.仪器与材料 UV-2401型紫外可见分光光度计(日本岛津)，旋转蒸发仪EYELA SB--2000（上海爱朗仪器有限公司)，水浴锅（上海爱朗仪器有限公司），芦丁标准品(中国药品生物制品检定所制，110737-200312)。淫羊藿（购于贵阳市三桥中药材批发市场），试剂均为分析纯。 3.方法与结果 3．1 标准曲线的建立 3.1.1 标准溶液的配制 精密称取芦丁标准品0.0180 g，置100 mL容量瓶中，加95％甲醇适量溶解，加甲醇至刻度，摇匀，配制成0．18 mg／mL 的芦丁标准溶液。 3.1.2 最大吸收波长的确定 取1.0 mL 标准溶液置25 mL 的容量瓶中，加入5％亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，分别加入10％硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，分别加入4％氢氧化钠溶液10.0 mL，最后加水至刻度，摇匀，静置10～15 min，在UV-2401型紫外可见分光光度计下扫描，得到如下光谱图1：
图1 通过工作站软件中的峰检测在200nm-710nm范围内扫描得出芦丁对照品在波长255 nm 处有最大的吸收，我们选定255为测定的波长。 3.1.3 标准曲线的绘制 精密量取上述标准溶液2.00 mL 置 100 mL的容量瓶中，用甲醇加到刻度，摇匀。再从中精密量取0.0 mL、1.0 mL 、2.0 mL 、3.0 mL 、4.0 mL 、5.0 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，加水至 6 mL ，分别按照上述显色法显色，在255 nm 波长处测得吸收度。测定结果如下表1： 表1
经回归处理得回归方程A=0.5217x+0.2072， R=0.9939，在0.144 ug ／mL～0.720 ug ／mL浓度与吸收度呈良好的线性关系，如图2。 图2 3.1.4 精密度实验 精密量取对照品溶液2.00 mL 置100 mL 的容量瓶中，用甲醇加到刻度，摇匀。再从中精密量取1.0 mL 置于25 mL 容量瓶中，按上述方法依次加入显色剂，定容，摇匀。静置 10～15 min，对照品溶液连续测定 5 次，测量结果如下表2： 表2
吸光度的RSD=0.35%。表明该方法精密度良好。 3.1.5 稳定性试验 取淫羊藿药材5 g，精密称定。加入15 倍量的水浸泡0.5 h，煎煮1 h，煎煮2 次。合并两次提取液，浓缩并定容至100 mL 容量瓶中。分别于0、0.5、1、2、4、8、24、48、72h内测定其吸光度值，如下图3所示： 图3 由数据结果算出RSD=2.94%。表明样品溶液在72小时内稳定。 3.1.6 重复性试验 取淫羊藿药材6份，每份5 g，精密称定。加入15倍量的水浸泡 0.5小时，煎煮2次，每次煎煮1 h。合并两次提取液，浓缩并定容至100 mL 的容量瓶中。按照对照品的显色法，在255 nm下测定其吸光度值，计算出淫羊藿药材中总黄酮的质量分数分别为1.51%、1.57%、1.60%、1.59%、1.54%、1.58%，RSD=2.17%，结果表明本方法重现性好。 3.1.7 加样回收率试验 称取已测定的淫羊藿药材6份，每份约2.5 g，精密称定。置圆底烧瓶中，各精密加入芦丁对照品约 39.3 mg，按重复性试验中的提取方法，测定吸光度和计算质量分数，计算结果如下表3。 表3
3.2 提取工艺单因素考察 3.2.1 抗氧化剂的选择 根据文献调研[5]常用于植物中黄酮的抗氧化剂有Na2S03和Na2S205。我们对这两种抗氧剂进行考察。现称取两份淫羊藿药材，每份20 g，分别加入15倍的 0.5% 的Na2S03和Na2S205的水溶液浸泡1 h，再煎煮2次，每次1.5小时。最后将它们提取液合并浓缩至250 mL ，每份提取液取三份，同上述标准溶液的显色法，在255 nm 处测定其吸光度值，并根据吸光度值计算测定总黄酮的提取率，计算结果如下表4： 表4
从表2的结果中可以得出：加 0.5% 的Na2S03的水提液对淫羊藿总黄酮的提取率高。因此水提液的抗氧化剂选择Na2S03。 3.2.2 抗氧化剂浓度的确定 根据文献调研[5-8],抗氧化剂的浓度在 1% 以下,我们选定 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%作为试验水平。称取5份淫羊藿药材，每份20 g ，分别加入15倍的 0.1%、 0.3%、0.5%、0.7%、0.9% Na2S03水溶液浸泡1 h，再煎煮2次，每次1.5小时。最后将它们提取液合并浓缩至 250 mL ，每份提取液取三份，同上述标准溶液的显色法，在255 nm 处测定其吸光度值，并根据吸光度值计算总黄酮的平均提取率，计算结果如下表5： 表5
从表3的结果中可以得出：含 0.3% Na2S03的水溶液对淫羊藿总黄酮的提取率较高，我们选定抗氧剂的浓度为 0.3%。 3.2.3 碱水PH值的确定 根据黄酮本身的结构特点，在碱性溶液中的溶解度大于在酸性溶液中的溶解度，我们选择碱性为提取条件。称取4份淫羊藿药材，每份20 g，分别加入15倍的pH为8～9、9～10、10～11、11～12四个不同梯度的氢氧化钠水溶液浸泡 1 h，再煎煮2次，每次1.5小时。最后将它们提取液合并浓缩至250 mL ，每份提取液取三份，同上述标准溶液的显色法，在255 nm 处测定其吸光度值，并根据吸光度值计算总黄酮的平均提取率，计算结果如下表6： 表6
从表4的结果得出： pH为 9～10 的水提液对淫羊藿总黄酮的提取率较高，因此确定pH为 9～10 为淫羊藿总黄酮的碱性提取条件。 3.3 正交设计 为了全面考察水提工艺的因素，我们设计了四因素三水平的正交实验。通过对药材提取过程中浸泡时间、煎煮时间、及加水量等因素的考察，研究提取工艺的最佳因素，实验方案见表7： 表7
实验方法：取干燥淫羊藿9份．每份50 g，按正交试验表进行操作。其中，提取液为含0.3%亚硫酸钠的，PH为 9～10 的氢氧化钠溶液。得到的提取液，静置过夜。抽滤，滤液浓缩至250 mL ，编号。再按标准曲线制定法，在255 nm 波长下测定各提取液的吸光度值，每个编号样品平行做3份。结果数据如下表8： 表8
根据实验结果及极差分析得出最佳工艺为：A2B1C3D2。即加15倍量水、浸泡药材 1 h、煎煮2次、每次1.5 h。 3.4 工艺稳定性验证试验 工艺的稳定性验证试验按照最佳条件进行6次验证性试验，结果淫羊藿总黄酮提取率分别为2.069％，1.987％，1.969％，RSD=2.64％，表明提取工艺比较稳定，重现性良好。 4.讨论 1．从极差分析表中可以看出，本实验工艺中四个因素对淫羊藿中黄酮提取影响因素从大到小依次是煎煮时间、浸泡时间、碱水量、煎煮次数。我们最终确定淫羊藿中总黄酮的提取工艺为药材加入15倍 0.3% Na2S03、pH为 9～10的碱水溶液，浸泡1h，煎煮2次，每次1.5h。 2. 查阅文献[9-10],很多的工艺直接用水提取，提取效率不高，根据黄酮本身的结构特点，其在碱水中的溶解度比在水中的溶解度大，本工艺采用碱水提取，大大的提高了淫羊藿中总黄酮的提取率。 3. 根据黄酮在水溶液中加热时容易被氧化的特点，本工艺在提取时加入了Na2S03 ，保护了黄酮母核在提取过程中不被氧化，这样使得淫羊藿中总黄酮的提取率也得到了提高。 参考文献 [1] 何丽君，等. 淫羊藿药理作用和临床应用的研究进展[J]，中医临床研究， 2020年 16(2)，17-20 [2] 侯集瑞，等．淫羊藿研究进展[J]，吉林农业大学学报，2004，26 (1)：59—65 [3] 张建博，等，淫羊藿提取工艺优化研究[J]，河南科技，2018年 17（1） 150-152：[4] 陈封政，李书华．淫羊藿总黄酮提取工艺的研究[J]_乐山师范学院学报，2003，18 (4)：33—34． [5] 李亮曜，叶利萍，颜雄，典灵辉，吴铁.淫羊藿总黄酮提取新工艺的研究[J]，广州化工 2008, 36 (4) 42 [6] 肖丽霞，张建良．槐花抗氧化剂的提取及其抗氧化性的测定[J]，江苏农学院学报，1996.17 （2） ：71-73 [7] 杨荣萍，李文祥，龙雯虹，杨正安．石榴DNA提取方法的比较及抗氧化剂对DNA质量的影响[J] ，云南农业大学学报，2005, 20 (5) ：624-626 [8] 信维平，孙建华，张褔娟．新型食品抗氧化剂阿魏酸的提取及应用的研究[J]，中国粮油学报，2006,21 (6)：126-128 [9] 何凌.淫羊藿总黄酮提取物的制备工艺研究[J],吉林中医药 2007, 27(11):57-58 [10] 王昌利,宋小妹,武新华,等. 淫羊藿总黄酮提取工艺研究[J].中成药,1996,18(5):1-3 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
