一、细胞培养所需的培养液 在细胞的研究和利用过程中,最主要的是要为细胞提供最适的生长条件,保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一,近乎呆板地坚守细节和常规,而且细胞培养,试剂昂贵,费时、费力,不是随随便便就可以进行的。 细胞只有在最适生长条件下,才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣,就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长,都不是最适生长条件。 二、平衡盐溶液 平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用,同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液(简称PBS) 。 三、血清 血清中含有丰富的营养成分,包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多,包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。 选择一批最适于细胞的血清是很重要的,而且如有可能的话,应要求购买来源公司保留足量,以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后,以低密度(直径6mm 的平皿中加入约103个细胞)接种5~6 个平皿, 其中一个平皿中加入含30%血清的培养液,以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后,出现肉眼可见的克隆时,倒掉培养液, 2%亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。 四、抗生素 一般细胞培养时,抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素, 如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml , 链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍, 分装为小包装, 于-20℃条件下保存。一次用一个小包装, 避免反复冻融 。 五、特殊的添加因子 特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适 培养干细胞时,常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ,又称分化抑制因子( DIA ) , 是一种分泌型多肽,可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般,可用纯化的LIF 直接加到培养液中,或使用用LIF 表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前, 多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便,与STO 细胞一起使用时,常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时, 常用浓度为500U/ml 。 体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上,添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液,且有商品供应,如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。 六、消化液 细胞生长至一定密度时,需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面,离散成单个细胞。常用的消化液是0.25% 、0.125%的胰蛋白酶和0.02%的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液,以无钙镁的PBS 或Hanks 溶液配制。它们可单独使用,也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白/0.02%EDTA 混合液。有些上皮细胞贴壁力强,需较高浓度的胰蛋白酶(0.25% )或延长消化时间,甚至需要37°C温育。如果温育较长时间(超过20min)细胞仍不能脱壁,则应采取分步消化的措施,即将已脱壁细胞移出至离心管,加完全培养液中和胰蛋白酶的作用,对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。 七、细胞培养用的其他液体 细胞培养时,还会用到其他一些液体,如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液,以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。 谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,会导致细胞因生长不良而死亡。因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故要适时添加。可配制200 倍液体-20℃ 冰箱中保存,在使用前加入培养液内,终浓度为2mmoVL 。 HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力,在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入,可明显改善细胞状态。通常配制200 倍液,-20℃ 冰箱保存,在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。 |
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