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噬菌体在宿主细菌中生长繁殖，能够引起致病菌的裂解，降低致病菌的密度，从而减少或避免致病菌感染或发病的机会，达到治疗和预防疾病的目的，这即是噬菌体疗法。随着抗生素在细菌感染疾病治疗中的副作用日益严峻，噬菌体疗法的重要性愈显。  噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，它遍布于各类生态环境中，有宿主菌的地方都有噬菌体的存在，因能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。 噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性。它的独特之处在于通过寄生在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终“吃掉”细菌。但是离开宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。 噬菌体的体积小，其形态有蝌蚪形、微球形和杆状等，以蝌蚪形多见。噬菌体由核酸和蛋白质构成。蛋白质起着保护核酸的作用，并决定噬菌体的外形和表面特征。其核酸有多种类型，DNA或RNA，双链或单链，环状或线状。 一、抗生素与耐药菌的威胁 近年来，细菌耐药性的威胁日益严峻，耐药性细菌感染对人体健康和经济发展带来巨大损失。 耐药性细菌和真菌具有强传播性，可以随着人、动物和商品的流动传播到各个国家和大洲，最终导致耐药菌遍布全球。
耐药性细菌感染严重威胁全人类健康。根据“联合国抗菌素耐药性特设机构间协调小组”截至2019年发布的报告，全球每年至少有70万人死于耐药菌感染，疾病控制和预防中心（CDC）的数据显示，在美国至少有23,000人死于抗生素耐药细菌的感染，欧洲约有33,000人死于耐药细菌的感染。 耐药性细菌的蔓延影响了经济发展。世界卫生组织估计，这一问题每年在欧洲造成的成本高达70亿欧元（合83亿美元），而美国为65亿欧元（合55亿美元）。据统计，到2030年，致病菌的抗生素耐药性可能迫使多达2400万人陷入极端贫困，预计到2050年，耐药菌感染每年可能造成1000万人死亡，对经济的破坏可与2008-2009年的全球金融危机相提并论。 二、耐药菌与抗生素治疗的发展和困境 抗生素与耐药菌的威胁 1920年代，噬菌体（bacteriophage，phage）在抗生素前首先被人类发现，在当时，许多研究人员认为噬菌体具有成为治疗剂的潜力，对噬菌体的研究也曾在生物技术和分子生物学领域做出过重要贡献。 然而，第二次世界大战前后，人们发现了抗生素，因其所具有的广谱性抗菌活性和非常有效性的杀菌效果被广泛使用。噬菌体在细菌感染治疗领域中作为天然抗菌剂的潜力逐渐被忽视，长久以来仅作为一种研究工具，仅在一些地方有零星的使用。 近年来，随着可以耐受所有已知抗生素的超级细菌不断出现，噬菌体疗法再次受到重视，并越来越有可能成为应对紧急公共卫生威胁强有力的解决方案。 下图概括了抗生素和耐药菌的简要发展阶段。
抗生素治疗耐药性细菌的困境 由于耐药菌的不断衍生导致抗生素越来越无法有效治疗细菌感染，这其中包括了抗生素治疗耐药菌疾病的医疗成本以及由于治疗低效所导致的死亡人数占比。根据美国疾病控制和预防中心2019年的报告和耐药菌威胁的严重程度。 下表整理了每种耐药菌在最近某一年中的感染病例数、死亡人数以及所花费的医疗成本，这一数据反映出目前耐药菌对人类健康威胁的严峻程度，寻找除抗生素之外的新疗法十分必要。
三、噬菌体疗法的技术进程 噬菌体疗法相较于抗生素的优势 针对耐药菌的感染，由于抗生素疗法需要承担高额医疗成本和低效率的特性，噬菌体疗法重新进入大众视野。噬菌体疗法（phage therapy），利用细菌的噬菌体来治疗致病细菌感染的抗生素替代方法，由于其所具有的专一性和有效性，该方法越来越被认为在防治耐药菌感染上有巨大的应用潜力。 噬菌体是高度特异性的杀菌剂，不会破坏微生物菌群。能够降低感染艰难梭菌和万古霉素耐药肠球菌的风险。 对宿主不会产生与化学结构相关的毒性。抗生素相关的毒性如:肾脏，骨髓，听力损失等。 不是对现有化学结构的增量改变，而是一个全新治疗类别。噬菌体具有独特的杀菌作用机制；不受限于细菌抗生素耐药性的活性；能够为多种耐药菌感染提供急需的治疗。 严格依赖宿主进行复制繁殖，仅在有宿主存在的情况下快速增殖。 可以通过合成生物学进行改造，增加额外功能，例如，生物膜降解，旁观者杀伤效应，组织定位。 噬菌体疗法的研究与应用发展 噬菌体疗法经历了抗生素发现前的兴起，二战后被抗生素替代的隐匿期以及近期用于耐药菌治疗的再发展。 下图总结了噬菌体疗法发展的时间脉络和重要节点。 详细关键事件发展时间线如下 1915年，来自英国的细菌学家Frederick Twort首次提出，噬菌体是一种病毒，是先前观察到的杀死细菌的“因子”。Twort在培养葡萄球菌的过程中,首次发现菌落上有透明斑出现。 1917年，巴黎巴斯德研究院的微生物学家 Felix d' Herelle 在Twort的研究成果上继续发展，首次提出噬菌体可用于治疗人类感染。Felix d`Herelle发现含有志贺痢疾杆菌的新鲜液体培养物能被某种无菌的污水滤液所溶解,并使混浊的液体培养物变澄清,将此种澄清液再过滤加到另一种敏感菌株的新鲜培养液中,可获得了相同的结果。他将这种能使混浊液体澄清的物质叫做“噬菌体”(Bacteriophage, phage)。后来他用志贺菌证实噬菌体具有治疗细菌疾病的作用,并分别用鸡的伤寒、兔的痢疾和人的杆菌性痢疾做治疗试验,都获得成功。 1919年，噬菌体第一次已知的治疗应用，Felix d'Herelle 和几个医院实习生摄入噬菌体鸡尾酒，检查其安全性，确认安全后用于治疗一个12岁男孩的严重痢疾，单剂量治疗后男孩的症状消失，几天内完全康复。 1921年，Richard Bruynoghe和Joseph Maisin使用噬菌体治疗葡萄球菌皮肤病。将噬菌体注射到病灶内和周围，感染在24至48小时内消退。 1924年，Spence和McKinley报道使用噬菌体治疗了19例细菌性痢疾，其中治疗组2例死亡，对照组12例中有5例死亡。他们还指出，治疗组的平均恢复时间为5.8天，而对照组为12.8天，反应了噬菌体在治疗中的积极的结果。 1924年，巴西里约热内卢的Oswaldo Cruz研究所开始生产抗痢疾噬菌体，以对抗拉丁美洲国家的痢疾。一年之内，该研究所生产了10,000瓶噬菌体，这些噬菌体被送往巴西各地的医院。 1929年，Larkhum使用噬菌体治疗疖病300余例，皮肤感染50余例，骨髓炎治疗也起到一定疗效。 1920s和1930s年代，世界各地的研究人员继续研究和测试噬菌体治疗人类细菌感染的能力。然而，这些研究的大部分结果都发表在非英语期刊上，因此没有立即传播到西欧和美国。 1916-1930年，D'Herelle 和其他人继续研究噬菌体的治疗用途，D'Herelle 使用各种噬菌体制剂治疗印度数千名霍乱和/或黑死病患者。D'Herelle及其合作者多次前往中国、老挝、印度、越南和非洲，以研究治疗霍乱和鼠疫引起的流行病，并用噬菌体对抗这些病原体，根据当时发表的数据，由于噬菌体的应用，印度霍乱的死亡率降低到10%。D'Herelle在他的书中提到了1931年在印度建立了两个生产抗霍乱噬菌体的工业中心，D'Herelle位于巴黎的商业实验室生产了至少五种针对各种细菌感染的噬菌体制剂。1931年，美国的公司Eli‑Lilly & Co、ER Squibb & Sons 和 Swan-Myers（雅培实验室的一个部门）开始生产用于治疗的噬菌体制剂。这些产品旨在治疗由葡萄球菌和“结肠杆菌”引起的感染。 1932年，Schultz等使用噬菌体成功地治疗了牙齿感染。 1934年，美国医学协会委托Eaton and Bayne-Jones报告了噬菌体疗法的功效，该报告发表于JAMA上。 1936年，Felix d’ Herelle和格鲁吉亚著名的细菌学家Giorgi Eliava共同创建了格鲁吉亚·埃利亚瓦细菌、微生物学和病毒学研究所（George Eliava Institute of Bacteriophage, Microbiology and Virology，EIBMV）。 该研究所至今仍然存在，自西方公司停止支持噬菌体计划，转而研发抗生素以来，该研究所一直是慢性感染患者的最后求救之处。在格鲁吉亚，药店有600多种不同的噬菌体，它们以特殊噬菌体鸡尾酒的形式出售。 1938年，一位著名的苏联外科医生Burdenko建议使用噬菌体来对抗化脓性感染。根据当时的报道，噬菌体疗法可以更快地缓解疼痛，改善患者的状况，并在2或3天后对伤口愈合有明确帮助。 1938年，Karamov使用噬菌体治疗感染了伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌的60名患者，但是并没有降低死亡率，尽管如此，前苏联关于治疗性噬菌体的研究仍在继续。 1939年，Sapir提出了关于痢疾噬菌体疗法效果的临床研究报告描述了莫斯科两个不同诊所共1064例用噬菌体治疗痢疾的病例，在噬菌体疗法1-2天后，观察到患者病情显著改善。 1939年，Belkina 研究了噬菌体与变形杆菌和志贺氏菌的相互作用，他将噬菌体添加到细菌和针对这些细菌的抗菌血清混合物中，发现这并不能阻止凝集，也不能溶解细菌，这表明特异性血清与细菌细胞表面结合，从而防止了噬菌体感染。 1939年，Ionov等发表了他们对抗痢疾血清和噬菌体特定作用的观察结果。该研究于1935-1936年进行，涉及502名患者。粪便标本的细菌学分析显示存在志贺链球菌和福氏杆菌，该实验证明了噬菌体和血清的联合疗法对治疗志贺链球菌和福氏杆菌感染有显著成效 1940年，Alexandrov等应用噬菌体治疗伤寒57例，得出结论，通过肌内和口服噬菌体联合应用获得的效果更好。 1940s年代，芬兰和前苏联在冬季战争（1939-1940年）期间首次大规模应用噬菌体。在战争的三个月中，大约6000名士兵接受了噬菌体疗法。像礼来（美国）和贝林-韦尔克（德国）这样的大型制药公司当时也专注于大规模生产噬菌体制剂，用于治疗上呼吸道和伤口感染等。但有人怀疑噬菌体并没有发挥那么好的作用，部分原因是它们的储存或纯化不当，而且当时人们还没有认识到，噬菌体对细菌感染的治疗有高度选择性。 1942年起，美国国家医学研究委员会与哈佛大学、宾夕法尼亚大学和 Overly 生化研究基金会合作，研究了一种抗痢疾噬菌体，该噬菌体在治疗中有正向反馈。 1949年，大连生物制品所在苏联专家的帮助下开始研制和生产痢疾噬菌体,主要针对志贺痢疾杆菌和福氏痢疾杆菌,这些噬菌体制剂在全国各地被广泛使用,尤其是在抗美援朝战争和国内大型水利工程建设中发挥了积极的作用。 1951年，Gnutenko报道了对于食品加工业工人的噬菌体疗法结果。伤寒沙门氏菌或者副伤寒沙门氏菌携带者，在1940年至1941年和1944年期间接受了噬菌体联合治疗，通过肌内噬菌体注射，以及噬菌体的直肠和十二指肠给药等一系列治疗，10名携带者中有6名携带者的伤寒沙门氏菌被清除。 1955年，大连所司穉东采取口服噬菌体的方法治疗痢疾患者，结果发现在服用噬菌体后的患者的脓血粘液便中，不论在其滤液或悬液中，全部都能检测出噬菌体。 1956年，何明达对某团驻地步兵爆发的流行性痢疾进行研究，试用了痢疾杆菌的志贺和福氏多价混合噬菌体(大连所1954年出品)进行治疗，并结合各项卫生预防措施有效控制了痢疾的季节性流行。 1958年，广慈医院(今上海瑞金医院)用噬菌体清洗烧伤后感染绿脓杆菌病人的伤口,病人最终痊愈出院。 1968年，Babalova等使用具有耐酸涂层的噬菌体片剂进行预防性治疗研究。这一项预防性实验是由第比利斯疫苗和血清研究所（Tbilisi Institute of Vaccine and Sera）受过专门培训的工作人员进行的，医生通过记录查看噬菌体注射儿童的情况来研究预防效果，发现发病率明显降低，因此建议片剂形式的痢疾噬菌体可以在预防疾病上，进行大规模应用。 1980s年代，西方科学家在20世纪80年代“重新发现”噬菌体疗法。H Williams Smith及其同事在20世纪80年代在动物疾病研究所(英国)进行多项动物试验研究，并于1982年至1987年，各在The Journal of General Microbiology发表四项研究成果； 从上个世纪八十年代起，抗生素耐药菌株的日益增长，这一威胁使噬菌体疗法越来越成为一个潜在的替代品。 1982年，H Williams Smith团队利用噬菌体成功治疗小鼠实验性大肠杆菌感染，发现其总体优势超过抗生素。 1983年，团队探究噬菌体对犊牛、仔猪和羔羊实验性大肠杆菌腹泻的治疗效果。 1987年，团队先后发表两份研究，分别探讨影响噬菌体在犊牛及其环境中生存和增殖的因素，以及利用噬菌体控制犊牛实验性大肠杆菌腹泻。 近20年来关键事件发展时间线如下： 2001年, Gorski等证实噬菌体可以诱导淋巴细胞和单核细胞的增殖。同年, Weber-Dabrowska B等对20名肿瘤患者(17名实体瘤患者和3名血癌患者) 和27名细菌感染者(8名金黄色葡萄球菌感染,9名绿脓杆菌感染,8名克雷伯菌感染和2名大肠杆菌感染)使用噬菌体疗法,发现所有患者的化脓、创伤、肺炎等并发现象都很快消失 。 2002年, Broxmeyer等以无致病力的smegmatis分支杆菌作为溶原性噬菌体TM4的病原性媒介,可抵抗巨噬细胞中分支杆菌(鸟分支杆菌或结核分支杆菌)的感染。 2004年8月，在佛罗里达州的比斯坎湾举行了噬菌体峰会，350多名与会者参加了几十年来第一次专门讨论噬菌体生物学的大型国际会议，显示了学界对这一领域迅猛复苏的关注。 2005年，瑞士雀巢研究中心的Anne Bruttin和Harald Brüssow开展一项噬菌体疗法的安全性试验，发表于Antimicrobial Agents and Chemotherapy，实验对象为人类志愿者，15名健康成年志愿者在饮用水中接受低剂量大肠杆菌噬菌体T4（10（3）PFU/ml）、高剂量噬菌体（10（5）PFU/ml）和安慰剂，实验测量了口服噬菌体在人体内的生物利用度，并发现口服大肠杆菌T4噬菌体后并无不良后果，呈现出噬菌体疗法的安全性，是合理评估噬菌体治疗腹泻的第一步。这标志着21世纪初，噬菌体的人体实验再次开始。 2009年，美国Ⅰ期临床试验的数据发表于Journal of Wound Care，试验由美国明尼苏达大学R.D. Wolcott团队进行。该试验在42名患有慢性腿部溃疡的病人身上测试了特异于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的混合噬菌体的安全性。因为这是Ⅰ期临床试验，只分析安全性，而不分析临床结果。没有与噬菌体相关的不良事件报告。 2013年，比利时的研究人员发起了一项临床试验，是世界上第一个根据GMP和GCP进行的噬菌体疗法前瞻性多中心、随机、单盲和对照临床试验，以测试噬菌体疗法对烧伤患者伤口感染大肠杆菌或铜绿假单胞菌的治疗效果。研究结果显示，噬菌体鸡尾酒疗法没有严重不良后果，展现该类疗法的安全性。 2013年，荷兰生物公司Micreos开发的全球第一个噬菌体裂解酶产品Gladskin上市,用于辅助治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引发的炎症性皮肤病。 2016年，加州大学圣地亚哥分校健康中心（UC San Diego Health）实施了美国第一项成功的静脉注射噬菌体疗法案例，对感染鲍曼不动杆菌的Tom Patterson进行噬菌体静脉注射，实现成功治愈。在此病例之前，美国只有极少数患者接受过静脉注射噬菌体疗法直接杀死多重耐药细菌，尤其是自抗生素问世以来。 2017年，上海市公共卫生临床中心成立了噬菌体与耐药研究所，是国内目前唯一获得噬菌体临床治疗资质的机构。 2018年，上海市公共卫生临床中心和中国科学院深圳先进技术院团队合作成功治愈第一位尿路感染多耐药肺炎克雷伯菌的患者。 2018年，耶鲁大学的Paul E Turner团队在Evolution, Medicine, and Public Health发表文章，表明一种取自当地池塘的噬菌体被用于治疗一名80岁男子胸部致命的细菌感染，使患者感染得以治愈，且没有复发征象。 2018年，Schooley 等人报道了一种用于为患有坏死性胰腺炎并发多重耐药性的68岁糖尿病患者提供基于噬菌体的个性化治疗的方法。他们展示了如何通过静脉和皮下将噬菌体注射到脓肿腔内，并展示患者临床中逆转、清除脓肿相关鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的感染。 2019年，Febvre 等使用商业大肠杆菌鸡尾酒疗法，在一项双盲、安慰剂对照的交叉试验中靶向噬菌体，其中正常及超重的成年人连续28 天摄入噬菌体，结果证明随着噬菌体的消耗，粪便中的大肠杆菌也在减少。 ·2019年，Maqsood 等表明细菌从母亲传给婴儿的肠道微生物群的形成受到噬菌体的影响。Verbanic 等通过深度测序表明噬菌体是伤口微生物组的一部分。 2019年，哈德萨希伯来大学医学中心Ronen Hazan团队在CLINICAL INFECTIOUS DISEASES上发表了，通过噬菌体与抗生素联合应用成功治疗骨伤耐药菌混合感染案例。治疗方法采用静脉注射两株噬菌体（滴度为5x107 PFU/mL），联用美罗培南和多粘菌素，期间监测内毒素浓度变化。在重症监护病房进行为期5天治疗，期间进行3次用药，没有观察到噬菌体疗法带来的有害影响。 2020年，Wang H等发现噬菌体是皮肤微生物组的一部分，正常皮肤和银屑病皮肤的微生物组之间存在差异噬菌体。 2020年，上海市公共卫生临床中心在国内率先成立超级细菌治疗科，通过噬菌体有效对抗耐药细菌感染。目前这个科室已经在临床上治疗了三十多位超级细菌的感染的患者。 2021年，Leitner等人在随机、安慰剂对照双盲临床试验中发现，在治疗接受经尿道前列腺切除术患者的尿路感染方面，膀胱内噬菌体疗法并不弱于标准的抗生素疗法。 2021年，以色列Ronen Hazan团队在the Lancet Microbe杂志上发表文章：常规微生物实验室即可操作的临床治疗用噬菌体选配方案。 2021年，中国科学院深圳先进技术研究院院马迎飞团队和深圳市人民医院重症医学科陈怀生团队、深圳市呼吸疾病研究所黄维团队，共同开展深圳市第一例应用噬菌体治疗耐药鲍曼不动杆菌肺部感染的临床试验，于2021年在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology被报道。 合成生物学助力噬菌体疗法的技术前沿  通过受体结合蛋白及其相关结构域的基因组工程技术，可以改变噬菌体的特异性并减缓抗性产生。 为了改善这些限制，合成生物学家改用设计原则，将自然界中的宽宿主噬菌体范围扩展机制，应用于可放大的合成模块噬菌体，创造一个基于先前验证噬菌体支架的可调整宿主范围噬菌体。 主要的宿主范围决定因子是位于噬菌体吸附装置末端(基板)或尾纤末端的受体结合蛋白。将宽宿主范围噬菌体应用于扩大或改变宿主范围的策略，包括: （1）受体结合蛋白(RBPs)等位基因与结构域交换，通过交换噬菌体尾纤C端结构域(CTD)中的球状受体结合域，同时保留与噬菌体尾纤相互作用所需的N端结构域，建立嵌合RBPs； （2）高通量多样化靶向RBP。利用抗体工程启发的靶向诱变方法，在肠杆菌噬菌体T3的 RBP-宿主细胞界面的非结构化环中产生多样性功能； （3）多价RBP噬菌体。在噬菌体基因组中插入了第二个针对不同血清型Listeria菌的rbp等位基因，构建了一种具有多价宿主细胞结合特性的合成噬菌体。 设计产生异源蛋白调节噬菌体抗菌活性 重新编程原位基因治疗载体，提供抗菌的“有效载荷”蛋白基因，如序列特异性核酸酶，可用于在复杂的微生物群中定位细胞。异源蛋白通常被描述为遗传的“有效载荷”，通过原位生产异源蛋白来增强或调节噬菌体的抗菌活性，噬菌体作为靶细胞特异性载体，传递可编程Cas核酸酶，最终有效地创建核苷酸序列特异性抗菌剂。 大数据和新型人工智能指导噬菌体设计 大数据和新型机器学习(ML)方法的出现，为生物学和医学研究带来了重大技术进步，能够实现指导未来合成噬菌体改良和设计。Bojar 等人最近的两项研究 ，利用自然语言处理创建了一个包含随时可得的噬菌体结合信息的糖链结构综合数据库，并推断了细菌种类的进化关系 。这为人工免疫驱动噬菌体的研究开辟了一个有趣的切入点。 类似于使用宿主范围信息作为分类标签，这些类型的实验数据可以很好地作为结构输入数据来预测噬菌体宿主的相互作用。 下期预告 技术精进必然推动市场向前，经过近一个世纪的沉淀，伴随技术突破和项目引导，噬菌体疗法已展现出强势的市场应用前景，然而，噬菌体应用的监管又对其大规模的市场化应用提出挑战。 下期内容将重点介绍噬菌体疗法的市场行业概况，市场主要参与者以及各国对噬菌体疗法的市场监管。敬请关注。 特别感谢马迎飞老师、黄术强老师、刘高雯老师的指导 —————— 内容/张鑫卉、洪祥达、沈琳、曾钰 编辑/吴蔚 |
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来自： 菌心说 > 《肠道菌群、微生态》
MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；VRE:耐万古霉素肠球菌；PDR:泛耐药；AMR:抗生素耐药性。（内容来自：ARMATA)
