前沿文献 | 宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用

前言

近年来，宏基因组二代测序技术( mNGS) 迅速发展。与传统病原学检测技术相比，mNGS 能无偏倚性直接分析出标本中的病原体谱、丰度和分布情况，改变传统病原学诊断模式，具有良好的应用前景。2021年1月，中国科学技术大学附属第一医院检验科戴媛媛副主任技师、马筱玲教授在《临床检验杂志》发表《宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用》一文，对mNGS在病原体检测、感染性疾病诊断、检测影响因素和结果判读等方面进行评述，并对存在问题和未来发展进行总结。

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mNGS在病原体检测中的应用

mNGS 能全覆盖检测细菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次体、真菌、病毒和寄生虫等所有病原体。与传统方法比较，mNGS在病原体检测方面有如下优势：

1.1 检测新发未知病原体

传统 PCR 检测技术的瓶颈是需要根据已知病原体序列信息预先设计引物，而mNGS能够对临床样本中的所有核酸序列进行无偏倚测序，能快速鉴定新发病原体。

2019年末在中国武汉出现不明原因肺炎患者，mNGS 在2019-nCoV的发现和鉴定中发挥了重要作用。

1.2 检测罕见病原体

mNGS 技术极大地增强了罕见病原体的检出能力，弥补常规检测方法不能覆盖罕见病原体的不足，例如巴氏阿米巴导致的脑膜炎、尿液中检出日本脑炎病毒、血液中检出沙眼衣原体、呼吸道标本检出西尼罗河病毒等。

1.3 检测跨物种传播病原体

mNGS 可揭示先前无法区分的动物来源和人类来源病原体的差异，追踪潜在的人兽共患疾病起源。

复旦大学附属华山医院感染科通过 mNGS 诊断了一名女性因直接接触猪的污染物而感染猪疱疹病毒导致眼内炎。

1.4 检测混合感染病原体

传统微生物检验具有偏向性，只能检出部分病原体，而mNGS可无偏向性地同时检出所有感染的病原体。

1.5 检测培养阴性的细菌/真菌性病原体

由于抗菌药物的应用、标本运送不及时、培养基及培养条件选择不正确等因素导致的培养阴性，或用常规方法难以培养或不能培养的某些细菌/真菌，可通过mNGS进行检测，如军团菌、肺孢子菌等。

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mNGS 在感染性疾病诊断中的应用

2.1 重症感染的诊断

mNGS技术对临床常见的重症感染，如脓毒症、脑炎/脑膜炎、重症肺炎等有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体。

斯坦福大学急诊医学中心纳入 580 例临床诊断为脓毒症的患者，验证血浆中游离 DNA 用于病原测序检测诊断效能，结果发现mNGS对脓毒症病原学诊断阳性率远高于培养( 48.6% vs 18.1%) ，有 53.7%的报告检出超过1 种以上的微生物。

2.2 慢性感染的诊断

由于慢性感染的症状不典型，机体间断性排菌，临床实验室检测困难，mNGS可辅助慢性感染的诊断。

2.3 疑难复杂感染的诊断

mNGS检测具有无偏倚性和全覆盖性的特点，对疑难感染病例诊断具有重要作用。

2.4 免疫缺陷患者感染的诊断

免疫缺陷患者容易发生机会致病菌感染和混合感染，而且感染的病原体复杂多样，诊断困难。mNGS可帮助免疫缺陷患者快速、精准地找到复杂多样的病原体。

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mNGS 检测影响因素及结果判读

3.1 mNGS检测灵敏度及影响因素

mNGS 检测灵敏度是指单位体积标本中检测到 1 条病原体序列所需要的病原体个数。需要的病原体个数越少，则灵敏度越高。mNGS 检测灵敏度与测序数据量( 检测总序列数) 及致病微生物基因组的碱基数呈正相关，与单位体积标本中人源细胞含量及背景微生物基因数呈负相关。提高mNGS灵敏度的有效方法是增加测序数据量、采取适当的方法去除人源性细胞、严格控制标本质量、减少环境和试剂中的背景微生物等。

在测序数据量确定的情况下，影响mNGS检测灵敏度有以下因素：

1	病原体基因组越大，mNGS检测灵敏度越高；
2	病原的细胞壁越厚，核酸提取效率越低，mNGS检测灵敏度越低；
3	RNA病毒遗传物质的丰度相对较低且容易降解，mNGS 对RNA病毒的检测灵敏度较低；

4	人源细胞在临床标本中的占比越高，mNGS 检测灵敏度越低；
5	临床标本中背景微生物占比越高，mNGS检测灵敏度越低。

3.2 微生物种类与结果判读

mNGS 检测具有无偏向性和超灵敏性的特点，即使针对无菌部位的标本，一次检测也可以匹配到多种微生物的序列。需根据检测的微生物种类、序列数( reads) 、参考疑似背景微生物库、阴性对照、临床特征进行综合判读。

1	检出明确的致病菌，如 MTB、诺卡菌、流感病毒、新冠病毒、曲霉、新型隐球菌等，即使序列数较低也可能是致病性病原体。
2	检出条件致病菌，如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、链球菌等，需要结合标本类型、序列数、微生物排名、动态变化及临床诊断综合判断。

3	检出常见呼吸道定植菌和皮肤定植菌，如草绿色链球菌、干燥奈瑟菌、白念珠菌、痤疮丙酸杆菌，一般不考虑为致病微生物，除非序列数特别高，并与临床症状吻合。
4	检出罕见特殊病原体，如炭疽芽胞杆菌，当症状、体征与临床认知不符时，可使用 Sanger 测序、PCR 方法或结合抗原/抗体检测进一步验证。

3.3 mNGS检测序列数与结果判读

序列数指匹配到该病原体的序列数目。序列数的多少与标本中病原体含量多少、病原体基因组大小、标本中核酸提取量呈正相关，而与标本中人源序列比例呈负相关。不同的病原体具有不同的序列数特点，要结合病原体的种类、序列数目、病原体排位等信息对每个病原体逐个分析，进行报告。

1	一般细菌：mNGS检测到某种细菌(种水平) 的序列数是其余所有细菌的10倍以上，有临床意义。
2	真菌：mNGS检测到真菌(种水平) 的序列数是其余所有真菌的5倍以上，有临床意义。

3	结核分枝杆菌（MTB）: 为明确致病菌，环境污染的可能小。此外，因 MTB 为胞内致病菌，细胞外游离 DNA 少，且 MTB 核酸提取效率低，mNGS 只要检测到 1 条属水平的 MTB 复合群序列，且能排除其他标本携带污染，就有临床意义。
4	非结核分枝杆菌(NTM) : NTM 可能是环境中污染菌，若检出，需结合背景微生物库和mNGS原始细菌列表进行结果判读。若排除污染后属水平或种水平序列数排名前十，则有临床意义。

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mNGS存在的问题及展望

1	标本的采集、核酸提取、基因文库构建、试剂选择、测序数据量和生物信息分析参考数据库和数据算法) 等缺乏标准化，测序过程和测序结果没有质控标准。
2	标本前处理操作复杂繁琐，涉及多次转管和移液操作，费时较长，容易出现操作失误和样本污染。
3	mNGS尚不能检测所有的耐药和毒力基因，也不能确定检出的耐药基因/毒力基因与感染菌的相关性，存在较高的假阴性和假阳性。

4	检测成本较高，外送检测周转时间( turn-around time，TAT) 较长。
5	mNGS 阳性结果仅代表临床标本中检出某病原体的核酸片段，无法确定该病原体与感染之间的关系，在有条件的情况下，还应用其他方法或者感染相关的标志物进行验证。

预计在未来5～10年内，mNGS操作将更加自动化，流程更加标准化，成本亦将显著降低，有望成为感染性疾病病原学诊断的常规检测技术。

参考文献：

戴媛媛，马筱玲. 宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用[J]. 临床检验杂志, 2021,39(1). DOI: 10.13602 /j.cnki.jcls.2021.01.01