【原】可变剪切如何验证？

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可变剪切的验证困境

通过测序，我们可获得大量的SNP突变位点。有些位点位于基因非编码区，如内含子、启动子、基因间隔区等，有些位点位于临近内含子和外显子交界处，我们可以挑选这些位点进行生信分析，筛选出可能与可变剪接相关的突变位点。

传统的生信分析预测工具，是以经典的剪接模型作为标准，进行筛选。但是可变剪接的机制是精密且复杂的，所以传统的生信分析算法无法准确模拟实际的剪接情况，常常会遗漏较多的致病位点。

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利用AI平台预测可变剪接

通过大数据分析的AI预测模型则可以解决这个问题。我们可以结合传统的生信分析和AI模型对我们的位点进行筛选，候选出我们感兴趣的位点，再开展下一步的验证实验。罕见病数据中心（RDDC）的AI工具可以进行RNA剪接预测。通过AI神经网络模型和生信数据算法逻辑进行处理，通过分析碱基突变中对蛋白编码翻译影响较大的剪切异常，得出碱基突变中真正导致基因疾病的最准确的原因。简单来说，只需要输入目的基因、转录本ID、突变位点位置和突变类型，即可得到预测结果。

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Minigene系统助力验证猜想

常规的验证思路是构建点突变细胞系，然后通过细胞表型分析和cDNA检测等方法验证异常可变剪接的猜想。但是当突变位点数量较多时，构建点突变细胞的时间和成本会提高。所以在这之前，先通过便捷的Minigene系统验证，则会大大提高成功率。

Minigene是在体外将含有突变位点或野生型位点的外显子及旁侧内含子克隆至载体上，然后将载体转染至细胞中，接着通过RT-PCR和测序，分析剪切的情况。大致工作原理是：克隆位点处可以装载待研究的外源外显子及旁侧内含子，在克隆位点上下游分别存在载体自带的外显子A和B。并且已经根据外显子A和B序列设计了RT-PCR的扩增引物，用于后续的检测。将构建好的载体转染到细胞中，野生型组会表达出含有外显子A+外源外显子+外显子B的mRNA。通过RT-PCR及测序就能知道其基因型。如果突变组可以产生异常的可变剪接，则表达出与野生型不一致的mRNA。

图 1 利用Minigene系统体外验证异常可变剪接流程

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Minigene应用实例

Minigene已经被广泛应用于异常剪接的研究。有研究者通过家系分析及测序发现EYS存在变异位点（图2），并且可能与遗传性视网膜变性发生相关。通过生信分析，他们发现有两次突变位点可能影响可变剪接，分别是: c.3877+1G>A和c.2992_2992+6delinsTG。

接下来，他们利用Minigene系统，验证了预测结果：第一个位点c.3877+1G>A，将24号内含子、25号外显子和25号内含子装载至pSPL3载体中，转染ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常可变剪接（图3）。

另外一个位点也是以相同的方法验证：将18号内含子、19号外显子和19号内含子装载至pSPL3载体中，分别转染HEK293T和ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常异常可变剪接（图3）。

图 2 EYS存在多个变异位点可能与色素性视网膜炎发生有关

图 3 Minigene系统验证异常可变剪切的发生