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原创不易  一、 研究流程图 本研究整合分析来自GEO中的7个ccRCC数据集和TCGA数据集，利用WGCNA和LASSO-COX分析开发一个稳健的预后基因signature。然后在两个独立的在线队列和一个临床组织微阵列（TMA）队列中验证该signature的预测能力。同时，结合临床病理学特征和预后基因signature构建nomogram来提高ccRCC的预测能力和风险分层。此外，本研究还进行了免疫微环境、免疫治疗反应和突变等分析。研究设计示意图如图1所示，干货满满，大家跟着小编一起学习下吧~  图1 研究设计示意图 二、 主要结果 1. 识别关键模块和关键基因 本研究将7个ccRCC GEO数据集中总共266例ccRCC样本和343例癌旁组织纳入RRA分析，以识别稳健的DEGs。然后基于上述的得到的DEGs，对TCGA队列（临床信息见图2a）进行WGCNA分析，最终识别出8个共表达模块（图2b-d）。根据模块-性状关系的热图，发现绿色模块与临床性状的相关性最高（图2e）。模块显著性分析进一步验证得出，绿色模块是与ccRCC患者生存状态相关性最高的模块（图2f）。因此，绿色模块确定为关键模块。然后从绿色模块中提取到53个候选关键基因。通过MCODE分析从PPI网络中选择105个基因。将候选关键基因与MCODE子模块中的基因取交集后最终获得49个关键基因，这些关键基因在肿瘤中表达上调。对关键基因进行Kaplan-Meier生存分析后，选择24个与ccRCC患者OS高度相关的关键基因进一步分析。  图2 WGCNA识别关键模块 2. 基因signature的构建和验证 TCGA队列中的患者按3:1的比例随机分为发现集（n = 398）和内部验证集（n = 133）。对24个关键基因在发现集中进行LASSO回归分析，得到4个生物标志物：FOXM1、TOP2A、KIF18B和NUF2（图3a），这4个基因均在TCGA队列中的肿瘤中均显著上调（图3b）。进一步利用作者所在机构的包含348个ccRCC肿瘤和癌旁组织的组织芯片（TMA）对这4个基因进行免疫组化分析后发现FOXM1、TOP2A和NUF2的蛋白水平在肿瘤组织中上调，而KIF18B在癌旁组织中上调（图3c-d）。KM生存分析发现，FOXM1和TOP2A高表达与OS缩短相关。因此，FOXM1和TOP2A用于计算风险评分。根据风险评分的中位值，病人可分为高低风险组。  图3 构建基因signature 为了验证基因signature的预测能力，对发现集、内部验证集、和2个外部验证集（E-MTAB-1980, n = 101；TMA队列，n = 348）进行了KM生存和时间依赖的ROC分析（图4）。四个数据集得到一致的结果，即高风险组生存率较低；该signature在3年、5年和8年都具有良好的预测精度。  图4基因signature的验证 3. 基因Signature与细胞周期的高度相关 高风险组高级别肿瘤（G3&G4，图5a）和晚期临床分期（Ⅲ&Ⅳ，图5b）发生率高于低风险组。进一步分析发现，FOXM1表达与年龄、AJCC分期、分级、肿瘤大小和坏死相关；TOP2A表达与分级、肿瘤大小和坏死相关。图5c展示了TOP2A/FOXM1表达与肿瘤级别的相关性，TOP2A和FOXM1的染色强度随着肿瘤级别的升高而逐渐增加。为了揭示TOP2A和FOXM1在ccRCC进展中的潜在机制，作者对TCGA队列的RNA-seq数据进行了GSEA（图5d-e）和GSVA（图5f-g）分析，发现TOP2A和FOXMI高表达组基因均在“细胞周期”和“同源重组”中富集。这些结果表明，这两个基因与细胞周期过程密切相关，高风险组ccRCC表现为细胞周期过程上调，这可能与肿瘤细胞的过度增殖有关，预后较差。  图5 基因signature与肿瘤分级和病理阶段高度相关以及对signature基因进行功能分析 4. 高风险和低风险ccRCC之间的免疫浸润分析 这种细胞周期相关的signature是否能反映肿瘤免疫微环境，我们通过ESTIMATE、CIBERSORT和IMMUNECELL Al这三种独立算法来评估免疫细胞在ccRCC中的浸润情况。发现，高风险组免疫评分显著升高，免疫细胞浸润增多（图6a）。而且，高风险肿瘤包含较高水平的免疫抑制细胞，例如regulatory T cells（Tregs）和Macrophages（图6b）。进一步对TMA队列进行mIHC实验，证实macrophages（CD68+）、FOXP3+Tregs和M2 Macrophages（CD68+ CD163+）在高风险组中的浸润比例明显高于低风险组（图6c-d）。这些结果均证实高风险肿瘤中有更多的免疫抑制细胞浸润。 为了进一步验证免疫抑制表型，作者分析了负向调节抗肿瘤免疫反应的免疫分子。研究发现，参与肿瘤免疫周期负调控的基因在高风险组中基本上调，提示高危患者的抗肿瘤免疫过程活性较低（图6e）。与对照组相比，PD-1、CTLA-4和LAG3在高风险组中显著过表达（图6f）。参与巨噬细胞和Treg诱导免疫抑制过程的趋化因子（IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β）在高风险组也显著上调（图6g）。这些数据表明，高风险患者在抗肿瘤免疫方面表现出惰性，这可能导致他们预后不良。  图6 高风险肿瘤呈现免疫抑制表型 为了进一步研究该signature与免疫治疗反应之间是否存在相关性，作者从文献中检索得到了156例接受nivolumab（抗PD-1药物）治疗的晚期ccRCC患者。他们可分为临床获益（CB）组、中级临床获益（ICB）组、无临床获益（NCB）组。图7a展示了高风险和低风险患者在三组患者中的分布。将ICB患者合并到CB组中进行后续分析。研究发现，低风险患者在CB组中富集，同时，与高风险患者相比，低风险患者的无进展生存期显著延长（图7c）。而且，比较了该基因签名与其他免疫治疗反应的生物标志物的预测价值。结果显示，PD-L1表达水平（图7d）、PBRMI突变（图7e）、肿瘤突变负荷（TMB）（图7f）在CB组和NCB组之间没有显著差异（图7d）。这些结果表明，本研究构建的基因signature在免疫治疗反应中具有强有力的预测能力，并且比其他公认的生物标记物更好。  图7 低风险肿瘤对抗PD-1免疫治疗的反应增加 5. 体细胞变异分析 作者还分析了TGGA中高风险和低风险肿瘤中体细胞突变。两组的突变全景差异如图8a-b。VHL、PBRM1、TTN和SETD2是在高风险和低风险肿瘤中最常见的突变基因。BAPI的突变率在高风险组显著升高（图8c）。PBRM1功能缺失的百分比在低风险组比高风险组高，但是没有显著统计学差异（图8c-d）。与PBRMI完整的患者相比，PBRMI功能缺失的患者的OS显著延长（图8e）。多因素Cox回归分析显示细胞周期相关特征和PBRMI突变状态是ccRCC生存的独立危险因素（图8f）。此外，结合PBRMI突变状态和基因signature可以提高风险分层能力（图8g）。  图8 TCGA中高风险和低风险肿瘤之间的体细胞变异 6. 基于细胞周期相关的signature构建预测OS的nomogram 对基因signature和临床病理因素进行单因素和多因素分析，构建nomogram。多因素分析显示，与低风险患者相比，高风险患者的OS明显缩短（图9a）。AICC分期、肿瘤大小和Fuhrman分级等独立预后因素也纳入nomogram（图9b）。最终构建的nomogram能够预测cCRCC的3年、5年和8年生存率（图9c-e）。时间依赖的ROC曲线显示，蛋白signature预测3年、5年和8年生存能力的AUC分别为0.74、0.75和0.72。在每个时间点，基因signature的所有AUC在预测生存概率方面都优于临床病理学因素。此外，nomogram在3年、5年和8年的预测准确度显着提高，分别为0.89、0.84和0.82（图9f-h）。  图9 基于ccRCC中的基因signature构建预测OS的nomogram 三、 文章亮点 1. 本研究整合分析来自GEO中的7个ccRCC数据集和TCGA数据集开发一个稳健的基因signature，该signature的预测能力在两个独立的在线队列和一个临床组织微阵列（TMA）队列中得到验证。文章数据量比较大，结果可信度比较高。 2. 加入了免疫浸润和突变等多角度分析。 3. 本研究分析了预后基因signature与免疫治疗反应之间的相关性，并且与其他免疫治疗反应的生物标志物的预测价值进行对比，凸显了预后基因signature在免疫治疗反应中强有力的预测能力。 |
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