阐明了环境中的RNA作为细菌的栖息地被利用的机制~期待以RNA为目标的难治性细菌感染症的预防和治疗方法的开发~

令和4年4月4日 东京慈惠会医科大学 东京大学 科技振兴机构( JST ) 阐明了环境中的RNA作为细菌的栖息地被利用的机制~期待以RNA为目标的难治性细菌感染症的预防和治疗方法的开发~ 本研究成果的要点 ①金黄色葡萄球菌(注1 )周围存在RNA (通常是进行遗传信息传递和蛋白质合成的物质)，发现该RNA被用于形成阻碍药剂和免疫作用的生物膜。 ②新发现被认为在细胞内侧发挥作用的RNA，在细胞外侧也发挥作用。 ③明确了金黄色葡萄球菌在菌外产生的多糖(注2 )在环境中RNA进入生物膜中起重要作用的机制。 ④有望开发新的难治性细菌感染治疗方法。 研究概述 自然界和人类体内等存在的细菌，聚集了被称为生物膜的细菌，形成了像栖家一样的生物膜，但是这个栖家建筑中使用的材料被称为胞外基质(充满细胞和细胞之间，或者细胞集团和细胞集团之间缝隙的物质)。 由于细菌周围被生物膜覆盖会阻碍抗菌药物和免疫系统的作用，致病细菌在人体内形成生物膜很难治疗，引起传染病的难治性慢性化。 因此，弄清楚病原细菌用于制作生物膜的材料和生物膜的制作机制，有望与难治性细菌感染症的新治疗方法的开发相关。 东京慈惠会医科大学细菌学讲座(主任教授金城雄树)的千叶明生助教、杉本真也副教授等研究小组与东京大学研究生院新领域创建科学研究科医学信息生命专业的铃木穣教授等一起，明确了病原细菌金黄色葡萄球菌利用周围的RNA作为生物膜的构成要素 另外，明确了金黄色葡萄球菌菌体外基质的成分多糖在RNA进入生物膜中发挥重要作用的机制。 由此，期待开发阻碍RNA进入生物膜的药剂和特异性分解生物膜中含有的RNA的酶制剂等以RNA为目标的难治性细菌感染症的预防法和治疗方法。 本研究成果将于2022年4月4日(星期一) (日本时间)在国际学术杂志《npj Biofilms and Microbiomes》上公开。

<研究背景> 据说大多数细菌以被称为“生物膜”的集合体的形式存在。 生物膜是细菌粘附在固体表面，在被称为菌体外基质的物质覆盖的同时形成的。 可以说，生物膜是细菌的“栖家”，其构成成分菌体外基质就是“建筑材料”。 生物膜的形成会妨碍抗菌药物和免疫功能的效果，因此成为细菌感染症难治化、慢性化的原因。 另外，细菌即使是同一个“物种”，根据“株”(注3 )的不同，菌体外基质的成分差异很大，因此生物膜的性质具有多样性。 因此，如果通过分析菌体外基质，能够明确生物膜新构成成分的实际情况，就有可能开发以该成分为目标的新型传染病预防法和治疗方法。 迄今为止的研究表明，菌体外基质中含有蛋白质多糖核酸(注4 )等，其中作为核酸的DNA (注5 )是各种细菌生物膜中的重要成分。 但是，关于与DNA相同核酸的一种RNA，虽然提示其有可能包含在菌体外基质中，但对于存在什么样的碱基序列的RNA、以什么样的机制进入生物膜等问题，完全不知道。<研究内容和成果> 迄今为止，本研究小组开发了引起医院内交差感染症的重要原因金黄色葡萄球菌形成的生物膜胞外基质的提取分析法(引用1 )。 应用该方法发现金黄色葡萄球菌临床分离株部分生物膜中存在丰富的RNA。 根据结果，RNA预想到生物膜内部的细菌的一部分死亡，从细菌细胞释放到外部的RNA迅速结合到其周围的菌体外基质中，作为生物膜的构成成分被吸收。 为了阐明这一假说，我们从胞外基质中纯化了RNA，并用新一代可编程控制器(注6 )对其序列进行了全面分析。 结果出乎意料，菌体外基质中几乎没有来自金黄色葡萄球菌的RNA。 由此认为，实际上，菌体外基质所含的RNA是从细菌周围的环境中摄取的。 于是，我们仔细研究了细菌的外部环境“培养基”(注7 )，发现它含有大量的RNA，这些序列大多与生物膜内摄取的RNA一致。 接下来，我们详细研究了RNA是如何被摄入生物膜中的机制。 生物膜内含有RNA的菌株产生了大量的菌体外基质成分之一的多糖。 由此，我预想多糖在将RNA摄入生物膜中起着重要的作用。 因此，用荧光色素标记多糖和RNA，用共聚焦激光显微镜(注8 )进行了生物膜的观察。 结果表明多糖和RNA存在于同一位点(图1 )。 另外，研究表明，从生物膜纯化的多糖与从培养基中纯化的RNA直接结合。 此外，研究人员还发现，从人类血液中纯化的RNA具有增加生物膜形成量的功能。 这提示进入人类体内的金黄色葡萄球菌使用血液等中含有的RNA增强生物膜的形成，怀疑与传染病的难治化有关联。 根据以上结果，明确了金黄色葡萄球菌使用自身产生的多糖，将环境中的RNA摄入生物膜的内部，作为生物膜这个自己的栖家的建筑材料来利用的结构(图2 )。 本成果是对以往有关RNA生理功能和生物膜形成机制的概念的扩充。 <今后的展望> 本研究表明，金黄色葡萄球菌通过胞外产生的多糖，使环境中的RNA进入生物膜，并作为其建筑材料利用。 另一方面，发现存在被生物膜吸收，增加生物膜形成的RNA和不存在的RNA。 也就是说，认为对生物膜的形成很重要的RNA在碱基序列上具有特异性。 但是，RNA通过什么机制增加生物膜的形成还不太清楚。 另外，金黄色葡萄球菌以外的细菌中也有很多以多糖为生物膜的构成成分，因此各种细菌将RNA用于生物膜的形成的可能性非常大。 今后，希望通过阐明这些课题，与各种病原细菌的生物膜控制方法和传统抗菌药物无法处理的难治性细菌感染症的预防方法和治疗方法的开发相关联。

  <附录> 本研究涉及日本学术振兴会科学研究费补助金年轻研究( A(15H05619 )、基础研究( b ) ( 20H02904 )、年轻研究( 20K16057 )、新学术领域研究基因组支持( 221S0002 )、新学术领域研究先进基因组支持( 16h 06279 ) 作为科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业总结实施型研究( ERATO )“野村集团微生物控制项目”( JPMJER1502 )等的一环进行。 <参考图>

图1 .在生物膜内部，多糖和RNA存在于同一部位的野生植株中，多糖形成网眼结构，该部分一致存在RNA (白箭头)。 另一方面，缺乏多糖类产生能力的植株，网眼结构消失，RNA无法进入。 DNA的定位显示了细菌内染色体的位置，也就是细菌的位置。 白线10米。

图2 .金黄色葡萄球菌生物膜的模型图 发现金黄色葡萄球菌的胞外基质除了含有DNA、多糖、蛋白质等已知构成要素外，还含有RNA。生物膜内RNA的主要来源是周围环境，很少部分来源于金黄色葡萄球菌细胞。 存在于细菌细胞外的RNA被作为细菌栖息地的生物膜中的多糖捕捉，被用作生物膜结构的建筑材料。 

  <用语解说> 注1 )金黄色葡萄球菌 基本上，这是一种在一些健康的人身上也存在的常驻菌。 但是，也容易形成生物膜，有时成为引起致死性传染病的病原细菌。 特别是对抗菌药物有耐药性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA )经常引起医院内交差感染，成为问题。 注2 )多糖 是葡萄糖和果糖等被称为单糖的物质结合形成的化合物。 金黄色葡萄球菌中，多种糖结合而成的聚N-乙酰葡萄糖胺是生物膜形成中重要的代表性多糖。 有使细菌细胞之间结合的作用。 注3 )种子和植株 “物种”是生物分类时的基本单位。 作为“物种”具有相同特征，但在分类只有一部分性质不同的东西时，使用“株”这一单位。 例如，即使是金黄色葡萄球菌这种同一“物种”的细菌，也存在着像MRSA那样对抗菌药有抗性的“株”和像甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌( MSSA )那样没有抗性的“株”。 注4 )核酸 是以碱、糖和磷酸组成的核苷酸为基本单元，它们连接了多个的高分子化合物。 存在脱氧核糖核酸( DNA )和核糖核酸( RNA )。 DNA是具有a (腺嘌呤)、t (胸腺嘧啶)、c (胞嘧啶)、g (鸟嘌呤)，RNA是具有a (腺嘌呤)、u (尿嘧啶)、c (胸腺嘧啶)、g (鸟嘌呤) 4种基本碱基的核苷酸 相连的序列被称为碱基序列，承担着遗传信息。 在生物的生命活动中，DNA主要作为基因，RNA作为以DNA信息为基础合成蛋白质时的中间物质发挥作用。 DNA和RNA的结构类似，但一般来说RNA更容易分解。注5 )生物膜中存在的DNA 细菌内部有一种叫做染色体的结构，由DNA组成。 正在增殖的细菌集团的一部分自然死亡，并溶解细菌。 细菌因溶菌而崩溃的时候，细胞内部的DNA会被释放到细胞外。 这种DNA作为胞外基质的组成部分，在生物膜的形成中起着重要的作用。注6 )新一代可编程控制器 以往，存在多个具有不同碱基序列的核酸时，很难解析所有这些核酸的序列。 近年来，作为能够同时确定数千至数百万核酸碱基序列的技术，开发了新一代可编程控制器。 这样，即使存在多个具有不同碱基序列的核酸，也可以解析这些序列。 注7 )培养基 是为了使含有细菌的微生物等增殖而使用的，人工制造的液体乃至固体物质。 成为繁殖生物的营养素的供给源。 根据细菌的种类存在各种各样的培养基，不仅有含有RNA的培养基，还有不含有的培养基。 注8 )共焦激光显微镜 这是扫描缩小后的激光以获取图像的扫描型荧光显微镜的一种。 检测荧光信号时，焦点位置以外的光被点光源(针孔)去除，因此在深度方向上产生分辨率，可以获得光学断层图像。 因此，与全面照射光的一般显微镜不同，即使是厚的试样也可以得到对焦的荧光像。

<论文信息> 论文名称: staphylococcus aureus utilizes environmental RNA as a building material in specificpolysaccharide-dependent biofilms (金黄色葡萄球菌利用环境中的RNA作为多糖依赖性生物膜的建筑材料) 杂志名称: npj Biofilms and Microbiomes 作者: Akio Chiba，Masahide Seki，Yutaka Suzuki，Yuki Kinjo，Yoshimitsu Mizunoe，and Shinya Sugimoto DOI: 10.1038/s41522-022-00278-z <引用文献> 1. Chiba A、Sugimoto S、Sato F、Hori S、mizunoe y.a refined technique for extraction of extracellular matrices from bacterial biofilms 8:392–403。