小动物活体成像领域的应用活体动物体内成像技术是指应用影像学方法,对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域,在研究细胞行为,药物活性和代谢,疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像(以Caliper和Xengon仪器为代表)和荧光成像(以KODAK和CRI仪器为代表)。 1. 荧光成像的推荐步骤: 1)SPF级 BALB/C裸鼠,6~8 周龄,18~20克,实验前24 h 自由进食、饮水。 2)于实验裸鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物最好溶于水(或甲醇/乙醇/乙二醇,有时DMSO 200uL能把小鼠杀死)稀释后,于裸鼠尾静脉注射200μL(浓度0.5 mg/mL)[最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化]。每5min 记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片,分析荧光药物的分布情况。 对照鼠不注射药物,进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器,进行成像。 3)Cy7 检测时激发波长700~770 nm带通,发射波长790 nm长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780~950 nm,扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。 不同的药物代谢时间不一样,注射入裸鼠体内,荧光立即分布全身,然后逐步向膀胱聚集,呈现显著的肾排泄的特点一般4~6小时,快的只有30分钟;如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7标记药物,有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。 器官切片观察:将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4小时以上,0%,20%,30%PBS蔗糖依次沉底,20μm切片,多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片,晾干,DAPI染色。共聚焦显微镜观察,激光器为氦氖 633 nm。 2. 荧光成像常见问题 1)什么类型的小鼠适合活体成像? 毛发对光有散射,建议用裸鼠。 2)给裸鼠注射的最佳和最大注射试剂体积? 试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同,下面是体重25g的裸鼠注射量。
3)注射针头的尺寸是多少? 推荐使用具有固定针头的28~32号结核菌素或胰岛素注射器(0.3或1mL) 4)肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体? 推荐起始用量50µg来优化最佳用量。 5)未标记的染料在老鼠体内如何代谢? 未标记水溶性染料通过膀胱排泄,静脉注射后最快能在3min检测到膀胱内的荧光信号。 6)注射后多长时间开始成像? 成像时间和成像持续时间与注射试剂有关。血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小时。注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时,而后才成像并持续成像数天。 7)Super Fluor dyes的荧光寿命是多少? Super Fluor 647在20°C水中τ=1 ns Super Fluor 680在20°C水中τ=1.2 ns Super Fluor 750在20°C水中τ=0.7 ns |
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