|
作者：朱沈悦，南京农业大学硕士在读。主要研究根际细菌铁载体的分离纯化。
 金属元素是生命活动的必需元素，是一些关键生化反应中必不可少的辅助因子。分泌小分子的离子载体来结合金属形成非共价复合物是微生物获取金属的一种常见策略。虽然金属元素对生命的分子机制至关重要，但有关从生物样品中发现金属-小分子复合物的系统方法却很有限。本文描述了一种两步构成的自然电喷雾电离-质谱法，将柱后pH调节和金属注入与离子识别分子网络相结合，形成一种基于规则的数据分析工作流程。该方法能够根据具有相同色谱图谱的离子的质量（m/z）偏移量，识别复杂样品中的金属结合化合物。这种天然电喷雾代谢组学方法拥有非常广泛的适用性，可以在一系列pH条件和样品复杂度下找到与任何金属（例如铁、铜、锌、钠和钙）相关的金属配合物，这种方法有可能成为检测生物学中金属结合分子的基本方法。
图1天然喷雾小分子结合实验概述 a.两步原生ESI-LC-MS/MS工作流程利用柱后注入氢氧化铵溶液或醋酸铵缓冲液，然后注入金属盐溶液（显示了第二代工作流程）b.数据可以使用MZmine和GNPS中的计算离子身份分子网络（IIMN）工作流程进行分析。  传统的反向LC-MS/MS倾向于检测到非结合态离子载体而不是金属结合态的载体。为了更好的检测样品中具有金属结合能力的物质，本文设计一种基于天然质谱代谢组学的两步法分析流程。由于pH值调整到生理值有助于在代谢组学实验中对具有金属结合亲和力化合物的检测，并且在酸性、中性和碱性pH水平下的的直接注入实验表明，在较高pH值下，金属加合物与质子加合物的比率较高。因此，本文使用的方法可以在不改变色谱法的情况下控制pH值。本文开发的两步法天然ESI-LC-MS/MS工作流程，主要通过将实时柱后pH调节与金属注入相结合，可直接检测结合金属的候选小分子。 第一代工作流程包含一个双管注射泵，用于注入氢氧化铵溶液，并随后注入一种或多种金属盐（图2a）。由于金属结合的速度非常快（毫秒），而柱后金属添加后需要约0.6s才能到达电喷雾入口，所以作者认为在色谱分离、pH调节和金属注入后有足够的时间建立金属-配体复合物。第二代工作流程使用了二级HPLC泵，该泵可提供醋酸铵缓冲补给流，同时注射泵输送金属溶液（图1a和图2b）。该工作流程有助于整个液相色谱梯度中的溶剂组成更加一致（且含水率更高）。因此，第二代工作流程被用于评估pH调节对金属结合的影响。在两种浓度和三个pH值（pH 2、5和9）下注入金属盐混合物——FeCl3、Cu(OAc)2·H2O、Mn(OAc)2·4H2O、Zn(OAc)2·2H2O、Co(OAc)2·4(H2O)和NiCl2，发现pH值较高时，Fe加合物的积分峰面积与H加合物的积分峰面积之比增加。为此作者选择对pH值大于5的情况进行后续研究，并使用第一代和第二代装置，观察那些在相同的保留时间和峰形状下的质子和金属结合络合物。为了更好的在大型数据集及通常包含数千个特征的复杂混合物中识别金属结合复合物，本文基于规则的信息工作流IIMN通过在与GNPS链接的MZmine中应用MS数据处理来克服这一限制（图1b）。通过使用IIMN，本方法对LC-MS特征根据其保留时间和色谱特征形状相关性进行分组，并定义为同一分析物分子的特定离子类型。之后，对所有分组的特性根据用户定义的离子标识库成对搜索。这种计算工作流程有助于搜索用户定义的任意特征m/z delta，从而能够找到与三价铁离子形成复合物的分子。此外，除了铁离子，此方法也适用于锌、铜、钴等离子结合的载体。
图2 a.双筒注射器（第一代）设置示意图 b.带有外部HPLC（第二代）设置的补充流程示意图 c.放大 d.缩小第二代装置的照片 金属结合特异性检验 为对天然代谢组学流程进行评估，作者选用了一些特征良好且可购买的铁载体标准混合物。在HPLC分离标准品后，作者通过第一代装置对柱后pH值进行调整并输注过量氯化铁。观察发现Fe加合物与H加合物（背景）的综合峰面积比率增加，这种增加取决于化合物，也可能和溶剂组成变化（尤其是有机溶剂的比例变化）有关，所以作者开发了第二代装置，配备了一个额外的补充流量泵，减少了梯度上溶剂成分的变化，并将有机溶剂浓度降低了约50%。 为了评估观察到的铁结合是否对已知铁载体具有特异性，或者在铁注入后是否形成非特异性加合物，作者将ferrichrome添加到没有铁结合特性的竞争分子物质中，并证实了铁加合的特异性。结果表明，在没有和存在过量（毫摩尔）铁的情况下，使用第一代天然电喷雾代谢组学工作流程证实，ferrichrome是唯一一种与铁结合对应的IIMN边缘连接的化合物，未观察到其他分子与铁结合（图3b）。
图3 LC后金属注入标准混合物中 金属结合选择性检验 除了测试特异性之外，作者通过注入生理水平的金属混合物（包含铁、铜、钴、镍、锌和锰盐），利用天然代谢组学法对金属结合的选择性进行验证。验证发现，不同测试标准物对不同金属选择性不同（图4）。例如，与之前研究结果一样，在铁载体-yersiniabactin存在的情况下，铜结合与铁结合发生强烈竞争。此外，两种ferrioxamine都表现出更高的铁偏好性。有趣的是，天然代谢组学方法可以区分两种非常相似的化合物-去铁胺E和B的结合偏好。去铁胺B表现出铜结合，但去铁胺E不具有铜结合的能力。
图4 一定pH值范围内混合金属注入。 发酵液中铁载体的检测 为了进一步评估对生物样品的选择性，作者将此工作流程应用于Glutamicibacter arilaitensis JB18275（JB182）的发酵代谢产物中。作者利用antiSMASH数据库对基因组数据进行挖掘，发现了ferrioxamineB和镰刀菌素的生物合成基因簇。与预测结果相似，使用本文开发的天然代谢组学工作流程，从培养物提取物中检测到apo-desferrioxamine E（DFE）和与铁结合的ferrioxamine E，并通过铁结合IIMN边缘连接。通过广谱与GNPS中分子网络进行匹配对DFE进行注释，发现只有DFE与铁发生结合（图5a），这说明了在LC后输注期间具有与铁结合的特异性，且在这个复杂的生物样品中没有检测到的其他分子中与铁结合（图5b-e）。
图5天然喷雾金属代谢组学用于鉴定细菌培养提取物中的铁载体。 由于前期实验发现yersiniabactin对金属结合具有的多样性、随机性，作者将天然代谢组学策略运用在大肠杆菌的发酵代谢产物中，以进一步研究该化合物的金属结合特性。首先，作者将柱后pH调节至7左右（基于大肠杆菌胞质溶胶pH）运行，并且使用IIMN识别一系列铁结合分子（图6a）。结果发现在这些化合物中包含yersiniabactin、aerobactin和yersiniabactin的衍生物HPTzTn-COOH，以及每个物质与铁的络合物（图4b-d）。此外，IIMN还发现了几种不同的能与铁结合的yersiniabactin（图6b、c）和aerobactin（图6d）的衍生物，这表明该发酵提取物至少存在15种额外的铁载体。随后使用SIRIUS通过手动检查保留时间来预测这些化合物的分子式，并手动检查MS/MS光谱以排除源片段，并提出假定的结构。这个例子说明IIMN在铁载体衍生物中具有的去重复化能力。这也表明分子网络具有识别结构相似性的能力。随后作者进一步对更加复杂的样品-真菌Eutypa lata测试了这种方法，与前文在大肠杆菌的流程一样。通过使用SIRIUS 4.082来阐明分子分子式，并假设注释了6个结构相关的新铁载体，再次强调了这种方法在发现新的类似物的应用潜力。
图6 天然代谢组学用于鉴定细菌和真菌培养提取物中已知和新的铁载体。 最后，作者将天然代谢组学工作流程应用于环境样本，测试该工作流程在超复杂样本中的对金属结合化合物的识别作用。作者采集了加利福尼亚洋流生态系统中的海水样本。其中表层海水中含有的DOM是实验室用UHPLC-MS/MS分析中最为复杂样品之一。应用天然代谢组学方法时，作者在将pH值调整至8左右（加州海流生态系统中海水的平均pH值）后注入金属。方法最终结果确定软骨藻酸（DA）可以与铜结合，与文献表述一致。这些结果证明将天然代谢组学应用于环境样品，可以很好的识别超复杂环境中的金属结合化合物。
图7 DOM样品的天然喷雾金属代谢组  本文描述的天然代谢组学法将柱后pH调节与金属注入相结合，再辅助使用MZmine和GNPS中的计算离子身份分子网络（IIMN）工作流程，实现了从复杂样本（如培养物提取物和DOM）中识别已知和新的离子载体。本文在进行微小技术调整后，在非靶向LC-MS/MS代谢组学工作流程中常规实施这种天然金属代谢组学方法，可以发现并阐明生物学中的金属结合小分子。此外，对该工作流程进行调整，可以更加详细了解金属结合选择性。本文概述的方法是唯一用于识别复杂样品中新的金属结合分子的方法，可进一步提高人们对于金属在从人类健康到农业、环境等各个领域中的作用的理解。 论文信息 原名：Native mass spectrometry-based metabolomics identifies metal-binding compounds 译名：基于天然质谱的代谢组学识别金属结合化合物 期刊：Nature Chemistry DOI：10.1038/s41557-021-00803-1 发表时间：2021.11 通讯作者：Pieter C. Dorrestein 通讯作者单位：University of California |
|
|
