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本文介绍由Atanas G. Atanasov和Claudiu T. Supuran共同通讯发表在 Nature Reviews Drug Discovery 的研究成果：在过去天然产物及其结构类似物对药物治疗做出了重大贡献，然而，天然产物也给药物发现带来了挑战，比如筛选、分离、表征和优化方面的技术障碍，导致制药行业降低对它们的关注。近年来，一些技术和科学的发展，包括改进的分析工具、基因组挖掘、工程策略以及微生物培养进展，正在应对这些挑战并开辟新的机遇，将天然产物作为药物先导重新引起了人们的兴趣。本文作者总结了最近可能实现基于天然产物进行药物发现的先进技术，并讨论了关键机遇和应用前景。  简介 天然产物（NPs）在癌症和传染病等药物发现中发挥了关键的作用，具有一些与合成分子不同的特性，例如支架多样性、结构复杂性和更高的分子质量等。这些差异在某些方面有利于药物发现，然而，也存在一些缺点导致制药公司减少了基于NP的药物发现计划。图1概述了NPs药物发现中传统的生物活性导向分离步骤，介绍了这些步骤中的关键限制，以及有助于解决这些限制的方法。该过程首先从细菌等生物体中提取NPs，为了提高提取的NPs的多样性，可以用几种不同极性的溶剂提取生物材料。在鉴定出具有良好药理活性的粗提取物后，通常进行多次连续的生物活性指导分馏，至分离出纯生物活性化合物。这种方法在识别新的NPs的一个关键限制是，许多潜在的源生物在离开其自然栖息地时无法培养或停止产生相关的NPs，可以通过开发新的培养方法、原位分析方法、NP合成诱导方法和生物合成基因的异源表达方法解决这个限制。在粗提取阶段的挑战包括提取的NPs已经存在、NPs不具有药物性质、用于表征的NPs数量不足，可以通过开发反复制工具、提取和预分离提取物的方法解决这些挑战。最后，当通过表型分析鉴定生物活性化合物时，通常需要花费大量时间和精力来鉴定受影响的分子靶点，这一挑战可以通过开发加速阐明分子作用模式的方法来解决。 本文作者讨论了近期可能有助于克服基于NP药物发现挑战的技术，重点在三个方面：分析技术、基因组挖掘和工程、培养系统，并强调了NP药物发现的未来前景。  图1天然产物药物发现中传统生物活性导向分离步骤概述 2 分析技术的应用 经典的基于NP的药物研究中，基于生物活性导向的分离过程有许多局限性，可以使用各种策略和技术来解决其中一些问题，其中，先进分析技术的应用使基于现代NP的药物发现成为可能（图2）。结合NP研究中使用的先进的分析仪器和计算方法，将代谢组学等“组学”方法应用于基于NP的药物发现中。可以组合使用核磁共振波谱、高分辨率质谱（HRMS），或涉及上游液相色谱（LC），例如LC–HRMS分析NP提取物。这种组合方法能够整合HRMS和NMR，具有允许同时使用两种技术的优势。然而，在数据挖掘和代谢产物的明确鉴别方面仍然存在挑战。 对生物提取物中的次级代谢产物的反复制有助于鉴别过程，包括分子量和分子式的测定，在文献或结构化NP数据库中交叉搜索分类信息。天然产物词典是一个结构化的NP数据库，包含所有报道的NP结构及其生物来源。Dorrestein实验室开发了全球天然产物社交（GNPS）分子网络平台，将分析物的关系可视化为结构相关分子的簇，加强反复制过程并阐明NP类似物之间的关系。METLIN49平台包括一个高分辨率质谱数据库，具有片段相似性搜索功能，可用于鉴定未知化合物。其他数据库和电子工具，如复合结构识别（CSI）和输入输出核回归（IOKR）可用于搜索可用的碎片离子光谱。 代谢组学数据可以与提取物的生物活性相匹配，加速鉴定提取物中具有生物活性的NPs。Kurita等人开发了一个复合活动映射平台，将高分辨率质谱（LC–HRMS）代谢组学应用于NP提取物筛选，示例图如图2a所示，对234种细菌提取物进行了基于图像的表型生物活性筛选和LC–HRMS代谢组学，最终发现了新的NP——喹诺酮酸霉素A–D。 在单细胞水平上分析生物活性分子反应也可以加速基于NP的药物发现。Irish、Bachmann、Earl及其同事开发了一个高通量的生物活性代谢组学分析平台，利用这个平台，作者研究了骨髓活检的单细胞反应，使得鉴定新的生物活性聚酮类化合物成为可能。 此外，分析技术的进步有助于对有意义的NPs进行严格的结构测定，例如高场强核磁共振仪器、探针技术和微晶电子衍射（microd）技术。  图2先进分析技术的应用使基于现代天然产物的药物发现成为可能 3 基因组挖掘与工程 关于NP生物合成途径的知识以及其用于分析和操纵基因组的开发工具的进展，是进一步驱动现代NP药物发现的关键因素。“基因组挖掘”通过搜索可能控制生物合成支架结构的基因，可用于识别NP生物合成基因簇。生物合成知识和预测性生物信息学工具的进步促进了基因簇的进一步研究，结合用于基因聚类分析的预测工具和光谱技术可以加速NPs的识别。对已知的次级代谢产物群体进行系统发育研究也有助于发现新的NPs，基因组学和系统基因组学分析表明，即使是经过充分研究的生物体组的基因组也含有许多次级代谢产物生物合成的基因簇。 许多微生物无法培养，或者用于基因操作的工具没有充分开发，使得获取它们产生的NP更具挑战性。可以在具有良好特征且易于培养和遗传操作的生物体中克隆和异源表达NPs的生物合成基因簇。Clevenger等人已经开发出自我复制的真菌人工染色体（FAC），使用FACs结合代谢组学评分开发了一个可扩展的平台FAC-MS，筛选事例如图2b所示，对真菌生物合成基因簇及其各自的NP进行表征，应用FAC-MS筛选了来自不同真菌物种的56个生物合成基因簇，发现了15种新的代谢物，包括一种新的大环内酯，丙内酰胺A。 即使在可培养微生物中，许多生物合成基因簇在常规培养条件下也可能无法表达，这些沉默的簇可能代表了一个巨大的未开发的具有药物性质的NPs。对沉默生物合成基因簇进行测序、生物信息学分析和异源表达可以确定此类NPs，直接克隆和异源表达也被用于发现新抗生素。然而，异源表达具有局限性，可以通过有针对性的基因操作（通常包括插入激活调节元件或删除抑制元件）直接在本地微生物中激活生物合成基因簇，或者通过阻遏蛋白诱导激活沉默的生物合成基因簇。 依赖测序、生物信息学和异源表达的方法还可以从尚未培养的菌株中鉴定新的NPs，如图3a。对于无法培养的微生物，优先考虑生物合成基因簇（BGC）的定向异源表达产生新的NP，如图3b所示，Hover等人搜索了2000个土壤样本的亚基因组，通过对从白色链霉菌宿主菌株的沙漠土壤样本中提取的72kb生物合成基因簇进行异源表达，发现了苹果酸素。另一种方法是直接使用“合成-生物信息学”化学合成类NP化合物，如图3c，Chu等人开发了一种基于人类微生物组的研究方法，发现了被称为腐殖霉素的非核糖体线性七肽，一种对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有效的新型抗生素。“合成-生物信息学”完全独立于微生物培养和基因表达，但其计算化学结构预测的准确性和全化学合成的可行性具有局限性。 此外，植物或动物的基因组也可以挖掘出新的NP。可以通过基因组挖掘利用最初从海洋生物中分离出来的生物活性化合物和植物微生物组。如果生产的微生物难以培养或NP产量太低，无法进行全面的NP表征，则可以利用NP生物合成基因簇的靶向基因工程，合理的基因工程和异源表达有助于提高产量。靶向基因操作也能够可预测的改变生物合成途径，以生产具有改进药理学性质的新NP类似物。生物合成工程的最新进展使NP类似物的生产更快、更高效。然而，生物合成工程对NP分子中可被修饰的部分以及可引入或去除的化学基团有限制。考虑到许多NPs的复杂性，全合成的成本可能很高，可以使用生物合成工程和化学修饰相结合的方法改进候选药物。    图3基因组挖掘驱动的天然产物和类天然产物化合物发现策略 4 微生物培养系统的研究进展 生产生物体的培养条件可能会对识别新型NPs产生重大影响，与标准实验室条件下的单一培养相比，应用先进的微生物培养方法可以识别新的NPs，并使“未培养”的微生物在模拟的自然环境中生长，进一步获取它们生产的新NPs（图4）。调节培养条件如温度、pH值和营养来源是促进识别新NPs的有效途径，可能激活沉默基因簇。“一株多化合物”（OSMAC）方法模拟自然栖息地复杂性的能力有限，可以使用“辅助”菌株进行共培养，或者与昆虫或其他有机体相互作用的微生物共生体，帮助在独特的生态环境中生产和鉴定NPs。为了重现本地环境复杂信号的影响，可以直接在分离的环境中培养微生物。图4a展示了这种策略在iChip平台中的应用，将稀释后的土壤样本播种在多个小室中，用半透膜与环境隔开，通过一种以前未经培养的土壤细菌产生了一种新的抗生素——泰索巴汀，证明了这种培养方法的有效性。 早期采用的微生物培养方法倾向于从易于培养的微生物中发现NPs，然而，需要培养之前未探索或研究不足的微生物群，生产具有全新支架和生物活性的NPs。Cross等人最近报道了一种分离和培养以前未培养的细菌的新方法（图4b），使用组学技术从复杂的群落中捕获这些微生物，并在纯培养物中分离它们。通过这种方法，成功地从人类口腔分离和培养出了以前未培养的细菌，通过三种糖化细菌（TM7）及其相互作用的放线菌宿主，以及SR1细菌，验证了这种反向基因组学工作流程。 尽管在培养策略上取得了一些进步，但人工条件仍然不能完全代表自然栖息地的复杂环境。为了避免这个问题，可以通过原位提取生物体和它们的NP保持微生物和NP的多样性。例如直接获得在自然海洋环境中产生的化合物；直接使用绿色溶剂进行现场萃取；使用小型化的分析设备促进原位分析，例如微型质谱仪和便携式近红外光谱仪等物理化学数据分析设备。  图4应用先进的微生物培养方法识别新的天然产物 5 NPs在药物发现中的应用前景 上述章节讨论的进展有利于重振基于NP的药物发现。NPs长期以来一直是抗传染病药物，尤其是抗生素的主要来源，利用这些策略选择具有抗菌特性的NPs，可以利用人类微生物组开发新型NPs，也可以继续开发和优化已知的NP种类。NPs也被运用于癌症治疗学方面，该领域的一个重要的新机遇是一些NPs引发针对癌细胞的选择性但有效的宿主免疫反应。NPs的另一个应用前景是含有复杂NPs混合物的植物疗法，混合物中各组分具有协同治疗的作用，随着表征技术的进步，如文中讨论的代谢组学，以及针对复杂的NPs混合物制定的监管指南，有利于开发混合物作为治疗剂。肠道微生物群在健康和疾病中起着重要作用，而NPs会影响肠道微生物群的组成，这一领域为基于NP的药物发现提供了新的机遇，未来的一个方向可能是为特殊的治疗应用进行单一的微生物群衍生物种的表征。在这些方面，上述培养策略、基因组挖掘和分析方面的进展将非常重要。 尽管本综述侧重于能够发现新型NPs的技术，但未经修饰的NPs可能具有次优的功效或ADMET特性，需要对NP进行化学修饰从而引导并最终开发出成功的药物，此外，将一种化合物引入临床需要可持续且经济可行的足够数量的化合物供应。在这种情况下，全化学合成和半合成方法使用一个NP作为生成类似物和生物合成工程的起点，修改生产生物体的生物合成途径，获得更好的类似物生产出有价值的新药。图5展示了获得性能优越的NPs类似物的策略，图5a介绍了以药理性质不理想的NP为起点，可通过全化学合成、类似物的半合成、生产类似物的生物合成工程操纵生物合成途径来生成具有优越药理特性的NP类似物。图5b,c分别展示了从金霉素A和芳环霉素衍生抗生素的例子，已经产生了几代成功上市的半合成和合成衍生物，图5d展示了生物合成工程方法在NPs的潜力。化学合成和生物合成工程技术的最新进展能够优化复杂的NP支架，促进基于NP的药物发现和开发。 最后，基于NP的药物发现的一个关键挑战是，科技专业知识往往分散在许多学术机构和公司中，需要集中支持学术界的NP研究，然而，近年来积极参与NP研究的大公司数量减少。改善学术界与产业界互动的一个传统解决方案是将相关专业知识集中在一个体系以及紧密的空间范围内。作者近期建立的国际自然产品科学工作组（INPST），为参与学术和工业实体的专业知识、技术和材料的整合提供了一个平台。 总而言之，NPs有希望发现具有高度结构多样性和各种生物活性的支架，可以直接开发或用作优化新药的起点。虽然药物开发总体上仍面临着高消耗率的挑战，NPs还具有可及性、可持续供应和知识产权限制等问题。本综述中讨论的科技进步为基于NP的药物发现提供了坚实的基础，以继续为人类健康和寿命做出重大贡献。   图5获得性能优越的天然产物类似物的策略 参考资料 Atanasov A G, Zotchev S B, Dirsch V M, et al. Natural products in drug discovery: advances and opportunities[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2021, 20(3): 200-216. 天然产物词典 http://dnp./faces/chemical/ChemicalSearch.xhtml FDA工业植物药开发指南 https://www./regulatory-information/search-fda-guidance-documents/botanical-drug-development-guidance-industry INPST: https:/// |
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