【原】《科学》| 基因编辑里程碑--CRISPR用于癌症治疗安全性过关

2018年11月26日，南方科技大学贺建奎副教授通过媒体宣布，11月在中国诞生了一对CCR5基因编辑的婴儿，他认为敲除CCR5基因会预防父亲携带HIV病毒可能产生的感染。此事一经宣布，在国内外便引起了轩然大波，随之而来的是公众的诸多质疑：

• 从科学层面，CCR5基因的敲除是否能确保孩子的健康极不明确，而该基因的已知以及其他未知功能的一并缺失，可能带来的副作用难以判断；

• 从技术层面，CRISPR技术在人胚胎研究中的安全性还有待于全面深入的探讨，目前脱靶和基因型嵌合等技术障碍依然无法避免；

• 从伦理层面，对于CCR5基因的敲除并不能给这个原本健康的婴儿带来明显的益处，却要承担未知风险。

由于上述诸多风波，近年来外界对CRISPR基因编辑的评价一直是负面的，但CRISPR技术仍然是一个伟大的科学发现，很多研究者和病人都寄希望于该技术。最近CRISPR基因编辑技术的应用似乎朝着积极的方向发展，更多的报道不再是基因编辑滥用，而是利用CRISPR技术治疗罕见病和恶性肿瘤，令人欣喜的是，诸多课题已通过临床试验证明该技术可有效治疗疾病。

2020年2月28日，顶尖学术期刊《科学》刊登了题为CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer（CRISPR工程改造的T细胞在难治性癌症患者中的应用）的一篇文章，论述了癌症免疫疗法的临床试验（试验：NCT03399448）最新进展。该研究数据涉及3名参与者，2名患有难治性晚期骨髓瘤（多发性骨髓瘤），1名患者患有难治性转移性肉瘤，且对之前的多种治疗无有效反应。经过CRISPR-Cas9编辑的新型T细胞免疫疗法的治疗，编辑后的 T细胞在体内存活时间长达9个月，未出现任何严重不良事件，CRISPR用于癌症治疗安全性过关。

而且，令人鼓舞的是，这是美国首次在癌症患者身上测试基于CRISPR基因编辑手段改造的T细胞免疫疗法，此研究为细胞疗法安全有效地应用在肿瘤治疗领域铺平了道路，为被癌症所困的患者带来了无限希望。

下面让我们由浅入深剖析下这篇来自《科学》的文章，了解下癌症治疗的前沿技术。

研究团队

该篇文章的通讯作者Carl June教授，是CAR-T细胞疗法创始人之一，被称为“CAR-T之父”。2011年，Carl June的团队用这种疗法成功治愈了一名急性白血病复发的小女孩艾米丽，使其成为世界首例通过该疗法治愈癌症的临床病人，堪称医学界的奇迹。

CAR-T疗法被证实在血液瘤领域（如白血病、淋巴瘤等）有较好的治疗效果后，团队又把这一疗法向实体瘤领域推进。如今，基因修饰的T细胞免疫疗法在实体肿瘤中也取得了令人瞩目的成就。相信该技术在他医学领域，如自身免疫所引起的一些疾病（如糖尿病、骨质疏松），也会大放异彩。

Ｔ细胞

Ｔ细胞作为人体内重要的免疫细胞，保护着我们免受各种疾病侵扰。它们通过其特有的表面受体TCR (T cell receptor) 与病变的细胞上主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC) 所递呈的抗原相结合，从而识别异己，发生反应。

然而，在实际上大部分癌症病例中，肿瘤细胞都可能会下调自身MHC递呈的肿瘤相关性抗原或者下调MHC的表达，以躲避Ｔ细胞的追踪；或者通过一些免疫抑制因子降低病人的整体免疫力，最终达成免疫逃避。这使得在体外对Ｔ细胞进行重编程或基因工程改造成为必然的趋势。

CRISPR-Cas9基因编辑技术

第三代基因编辑技术——CRISPR-Cas 9是继锌指核酸酶(zinc finger nuclease,  ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALENs)之后的又一个如日中天的基因编辑工具。

CRISPR-Cas 9技术的兴起弥补了ZFN和TALEN的多种不足，其同时具备了设计简单、靶向高效、适用广泛和成本低廉等优势，而人们持续不断地深入研究和优化使之成为推向临床使用的极具潜力的一项利器。

试验过程

试验步骤：

1

1. 从患者身上采集T细胞；

2. 使用Cas9-RNPs电穿孔T细胞，靶向处理内源性TCR和PD-1的编码基因；

3. 使用CRISP-Cas9敲除编码内源性T细胞受体（TCR）链的基因TCRα和TCRβ，以及编码PD-1蛋白的基因；

4. 使用慢病毒载体为工程化TCR提供识别NY-ESO-1的基因；

5. 工程化的T细胞表达NY-ESO-1 TCR；

6. 将多次编辑的T细胞回输到患者体内。

试验核心：

2

• 敲除TCR：内源性TCR(T-cell receptor，一种癌细胞识别蛋白)与改造后的TCR（TCRα和TCRβ）相互竞争，干扰信号传导或细胞运输。敲除2个编码内源性T细胞受体（TCR）链的基因TCRα和TCRβ，可以减少TCR配错，改善工程性T细胞的功能和持久性。

• 敲除PD-1：T细胞的活性由于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）受体的存在会出现自然下调。对患者PD-1的抑制作用可增强T细胞活性，但通常会引发不良的自身免疫反应。故敲除编码PD-1蛋白的基因，可提高安全性和减少自身免疫所致毒性。

• 插入NY-ESO-1：接着利用慢病毒插入一个亲和力被增强的T细胞受体基因，使得被基因编辑的T细胞可靶向癌细胞上名为NY-ESO-1的抗原。NY-ESO-1的作用相对于”探头”，可以用来靶向识别肿瘤细胞，追踪工程化T细胞以监测其功效。

小结：

3

研究人员用CRISPR技术敲除了T细胞内的3个基因：分别是2个编码内源性T细胞受体（TCR）链的基因TCRα和TCRβ，以及编码PD-1蛋白的基因。插入了1个基因：NY-ESO-1（癌症-睾丸抗原，是一种特异性强，而毒副作用弱的靶标抗原）。因此改造后的T细胞命名为NYCE (NY-ESO-1 transduced CRISPR 3X edited cells)。最终，经过4次编辑的T细胞被回输到患者体内。

试验结果

• 经过Crispr-cas 9 技术多次编辑的T细胞是安全的。实验结果表明：三位患者并未出现明显的免疫排斥反应和与工程化T细胞相关的毒性反应。虽然T细胞编辑过程中，在体外观察到染色体易位，但在输注给患者后随着时间的推移而减少。

CRISPR-Cas9工程化T细胞并未引起严重的副作用

• 经过Crispr-cas 9 技术多次编辑的T细胞在体内持续时间更久。实验结果表明：经过精准编辑的T细胞，以稳定的水平移植到三位患者体内后，在最长达9个月的时间内，患者体内仍可以检测到经过基因编辑的工程化T细胞。此次实验T细胞存活持续时间较之前的临床试验都长。

CRISPR-Cas9工程化T细胞在3名患者体内持续扩增和存活

• 经过Crispr-cas 9 技术多次编辑的T细胞表现了持续的攻击和杀死肿瘤的能力。实验结果表明：从患者体内分离出经基因编辑的T细胞，经实验室检查仍有杀死癌细胞的能力。骨髓和肿瘤的活检结果均显示T细胞靶向定位肿瘤部位发挥免疫作用。尽管肿瘤活检显示有部分残留，但在两名骨髓瘤患者中，靶抗原NY-ESO-1和/或LAGE-1均减少。该结果与工程化T细胞的靶向作用一致，说明工程T细胞在体内表现了杀伤肿瘤细胞的能力。

患者的肿瘤缩小情况（红色为肿瘤区域）

试验的潜在问题

同期发表在《科学》杂志的另一篇题为Knocking out barriers to engineered cell activity的文章，对此次临床试验给予了充分的肯定，但同时也提出来可能存在的潜在问题。

• 目前尚不清楚Cas9编辑的细胞到底是否具有免疫原性，以及残留的Cas9（一种细菌蛋白）是否会触发免疫反应。临床试验的三名患者没有表现出明显的免疫排斥与NYCE细胞毒性，但是研究过程中三位患者体内针对于Cas9蛋白，而预先存在的T细胞和抗体滴度并未比基线增加。

• 此次试验使用CRISPR-Cas9对T细胞进行了多次精准编辑，以实现最小的脱靶率。有30%的T细胞的3个靶序列均没有发生突变，但40%发生了1个突变，10-20%发生了双突变和三突变。在输注后的第10天到4个月之间，T细胞的序列一直比较稳定，4个月之后，约有40%的外周血液中的T细胞可以检测到任一靶基因处发生了突变。

• 这项研究仍未解决的最大问题是，CRISPR编辑的工程化T细胞是否对晚期癌症有效。1期临床试验评估了NYCE细胞的安全性，但未评估其治疗癌症的功效。在试验结束时，一名参与者因癌症而死亡，另外两名正在接受其他疗法。

小结

对于此次临床试验，CRISPR先驱Jennifer Doudna博士表示：“这是在患者中使用CRISPR-Cas9基因组编辑的道路上迈出的重要一步，显示了这项技术成为一种安全有效疗法的潜力，为下一代细胞疗法铺平道路。”

尽管其他类型的基因编辑体细胞（例如干细胞）的安全性尚待确定，但令人鼓舞的是，有研究结果显示首批注入CRISPR-Cas9修饰细胞的β-地中海贫血和镰状细胞性贫血患者，其身体产生了健康血液。 

相信未来还会有其他基于基因编辑的疗法被证明是安全有效的，到那时，更多的研究精力会被集中到细胞的生产和管理，以及成本问题上，让越来越多的患者能够受益于基因编辑。

前景展望

癌症治疗的研究一直是数年来的科学难题, 受限于癌症发生发展的复杂性, 以及肿瘤细胞的特点, 使得癌症的治疗往往出现易复发和转移等特点。肿瘤的免疫治疗近来备受关注，包括重组抗原疫苗、基因编辑T细胞、溶瘤病毒和免疫检查点阻断治疗等。

基因编辑的工程化T细胞是目前最具革命性的癌症治疗手段。区别以往传统的化学疗法、放射性疗法以及药物靶向性疗法，该方法不直接作用于肿瘤本身使肿瘤细胞死亡，而是作用于病人自身的免疫系统，刺激并增强其对肿瘤的再识别与杀伤能力，因此在多种肿瘤中都具有一定的适用性。

近两年来, 对于T细胞进行武装增强免疫原性, 加强T细胞对于肿瘤的杀伤力, 已经取得了重大的进展。文中的介绍的CRISPR-cas9编辑的T细胞已进入了临床阶段，用于治疗其他方法无效的晚期癌症，并初步证实了方法的可行性，这无疑是癌症治疗路上的又一道曙光，给人以无限的鼓舞。

虽然基因编辑的工程T细胞仍然存在基因脱靶、安全性、有效性等方面的诸多问题，但是毫无疑问，这是CRISPR基因编辑和细胞疗法的临床应用的重要一步。期待在不久的将来，基因编辑技术可以打破重重壁垒，拓展到癌症治疗的更广范围，造福于更多的癌症患者。

参考文献：

[1] Stadtmauer, Edward A., et al. "CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer." Science 367.6481 (2020).

[2] Hamilton, Jennifer R., and Jennifer A. Doudna. "Knocking out barriers to engineered cell activity." Science 367.6481 (2020): 976-977.

[3] C. R. I. S. P. R. Therapeutics, https://crisprtx./static-files/f1e96190-16d1-447c-a4f6-87cc28cc978f (2019).

[4] Watanabe, Keisuke, et al. "Expanding the therapeutic window for CAR T cell therapy in solid tumors: the knowns and unknowns of CAR T cell biology." Frontiers in immunology 9 (2018): 2486.

[5] 胡边. CRISPR-Cas9介导的人原代T细胞的基因编辑[D].南京大学,2018.

[6] Couzin-Frankel, Jennifer. "CRISPR takes on cancer." (2020): 616-616.

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