|
由大豆疫霉引起的疫霉根和茎腐病是一种世界范围内的破坏性大豆土传病害。发现赋予病原体广谱抗性的基因是预防疾病必要条件。在这里，我们发现大豆Rps11是一个具有27.7 kb 核苷酸结合位点的重复基因，具有对病原体的广谱抗性。rps11是大豆中含有单一来源的大型 NLR 基因簇的基因组区域，其来源是多轮不等重组，此类事件导致启动子融合和 LRR 扩展，这可能有助于广谱的抗性。NLR基因簇在具有系统发育代表性的品种中表现出很强的结构多态性，并且在所检查的任何非Rps11供体品种中都没有Rps11的等位基因拷贝，这体现了 NLR 基因和 NLR 基因簇的创新进化。 输入文 期刊名称：nature communications 作者：Weidong Wang, Rajat Aggarwal & Jianxin Ma 单位：Purdue University, Corteva Agriscience 主要结果 1、单独的Rps11基因座调控广谱抗性 我们最近在大豆地方品种 PI594527 中，鉴定了一个Rps基因座，命名为Rps11，它对12个病原小种8具有抗性。基于来自 PI 594527 和易感品种 Williams 之间杂交的对病原小种的反应，Rps11最初被定位到染色体 7 8上的一个 348 kb 基因组区域。 为了消除可能的组装错误导致的初始Rps11映射结果中的潜在不准确性，我们注释并比较了包含来自 PI 594527 基因组组装的整个 NLR 簇的 Rps11 区域和来自 Williams 82 基因组组装 v3.0 的相应区域。来自 PI 594527的~648 kb Rps11区域由 12 个 NLR 基因（称为 R1-R12）组成（图 1a）。其中，R1、R4、R6、R7、R9、R11 和 R12 是完整的，预计编码含有 2315-2463 个氨基酸的大型 NLR 蛋白；R2、R3、R5 和 R8 被截短，在它们的 3' 端丢失了 2 到 4 个外显子；和R10在其第一个外显子中携带 1.4 kb 插入。正如通过 RNA 测序（RNA-seq）所揭示的，只有 R1、R4、R6、R9 和 R12 在茎中表达（补充图 4b）。Williams 82 组装 v.3.0 中约 522 kb 的相应区域由 8 个 NLR 基因（称为 r1-r8）组成。在这些基因中，R8-r7 似乎是两个基因组之间唯一的等位基因对（图 1a）。事实上，只有一小部分区域在 PI 594527 和 Williams 82 之间作为同线块共享，这仍然允许我们设计用于精细映射的标记（图 1a）。
Fig. 1: Map-based cloning of the Rps11 locus. 2、通过监测基因表达确定Rps11的候选基因 鉴于功能性 NLR 必须转化为蛋白质，作为细胞内受体，以介导病原体无毒效应子的特异性识别并激活免疫反应，我们监测了接种茎中R5、R6、R7 和 R8 的表达与P. sojae小种 1 和 PI 594527 中未接种的茎。在四个基因中，只有 R6 在接种的茎和未接种的茎中表达，而 R5、R7 和 R8 在这些相同的样品中不表达，并且正如预期的那样， R6的表达对病原体有反应。因此，R6 是Rps11唯一可能的候选者它的存在可以通过它的表达来监测。这一结论进一步得到观察结果的支持：所有检测到 R6 表达的重组体对病原菌具有抗性，而所有未检测到 R6 表达的重组体对小种 1 敏感（图 1c） . 总之，这些观察结果强烈表明 R6 确实是Rps11，它也在其他组织中表达（图 1d）。 3、Rps11赋予的抗性通过遗传转化得到证明 为了进一步证明Rps11的功能，我们通过开发Rps11转基因品系并检查它们对病原体的反应进行了互补测试。理想情况下，将Rps11基因组 DNA 转化到具有自身启动子的大豆中，以最好地揭示Rps11赋予的抗性。然而，鉴于从 TSR 到 TTS 的Rps11的大尺寸（27.7 kb），其启动子区域在 TSR 上游的边界不明确，以及在大豆中转化如此大的片段的预期困难——这是最困难的片段之一即使是小至几 kb 12的 DNA 片段也能转化作物——我们决定使用拟南芥的启动子泛素基因AtUbi3 (p AtUbi3 )，以驱动Rps11 CDS (CDS- Rps11 ) 表达（参见“方法”）。p AtUbi 3::CDS- Rps11构建体被引入优良大豆品种 93Y21。正如预期的那样，具有转基因的T 2后代对这三个种族的抗性水平与源自作图群体的纯合RIL（Rps11 / Rps11 ）显示的水平相似（图 2a，b）。相比之下，非转基因（对照）对这些相同的种族敏感（图 2a，b）。此外，正如预期的那样，在那些 T 2后代中检测到Rps11 -转基因的表达（图 2c），并且其在两个转化事件中的每一个中的表达水平与抗性水平相关，如接种的存活率所示幼苗。
Fig. 2: Complementation test results. 讨论 我们使用基于无间隙序列的精细定位和克隆方法分离了 Rps11，该Rps11赋予大豆中对大豆假单胞菌的广谱抗性。鉴于 NLR 基因簇的结构和基因拷贝数变异如此之大，以及大豆泛基因组中Rps11基因座缺乏等位基因拷贝。许多研究揭示了 NLR 基因的结构和拷贝数变化是植物病原体抗性的基础。在玉米中，发现赋予锈病抗性的Rp1基因座两侧有额外的 NLR 基因，并由许多不相等的基因间重组事件形成，特别是在 LRR 结构域中，它产生了各种突变，其中一些能够改变种族-电阻率。在高粱中，发现赋予对真菌病原体Periconia circinate抗性的Pc基因座是一个 NLR 基因，其两侧有额外的 NLR 基因，并且该基因座的抗性经常通过侧翼 NLR 基因之间的定点不等重组来克服。最近，对 26 个不同的玉米基因组进行了测序，从而可以一窥rp1区域中的单倍型变异。该区域表现出rp1的基因组间拷贝数剧烈变异，但这些基因组的一部分在该区域仍然存在差距，并且基因组中rp1区域和许多其他 NLR 簇的结构和进化过程仍有待分析。 材料和方法 1、基因组组装 使用Pacific BioSciences Sequel 平台生成长读长数据。共测了八个 SMRT cell，原始子读数被过滤到最小 12 kb，产生 77 × 基因组覆盖。原始reads N50 长度为 28.9 kb。通过在 Illumina HiSeq2500 平台上以 PE150文库进行测序，生成短读长数据。文库的覆盖深度和平均分子长度分别为 45.2 × 和 93.8 kb。 基因组图谱是在Bionano Saphyr 平台上生成的。得到的基因组图谱以去除覆盖率和长度异常值。最终的基因组图谱组装由 43 个图谱组成，基因组图谱 N50 为 26.7 Mb，图谱总长度为 985 Mb。 NLR基因注释和表达分析 NLR 基因使用 NLR-Annotator进行注释。使用 RNeasy Plant Mini Kit从每个关键重组体幼苗的混合茎组织中提取 RNA 样品，并用 RNase DNase Set处理以去除 DNA。使用 sra-toolkit v2.11.0收集和提取公共 RNA-seq 数据。使用 STAR v2.7.9a将 RNA-seq 数据映射到供体系的基因组并根据映射到每个 NLR 基因的读取数计算表达，通过定量实时 PCR 进行基因表达谱分析。 2、质粒构建与转化 为了构建Rps11候选基因R6的过表达构建体，通过Genscript将R6的CDS合成为三个片段，并在酵母中通过同源重组与AtUbi3启动子和Gateway ATT位点组装成Gateway进入载体。使用 Gateway Technology 和 Clonase II (25–0749, Invitrogen) 通过 attL-attR 重组反应将其重组为 Gateway 目的载体，以转化为Ochrobactrum。灰杆菌属如前所述进行介导的大豆胚轴转化。用氯气对成熟的大豆品种 93Y21 干燥种子进行消毒，并在室温下避光在含有 5 g/L 蔗糖和 6 g/L 琼脂的半固体培养基中吸收。过夜孵育后，将种子在室温下在黑暗中在蒸馏水中再浸泡 3-4 小时。分离完整的胚轴外植体，并用 15 mL 的Ochrobactrum haywardense转移到深板H1-8 悬浮液（600 nm 处的光密度 0.5）在由 1/10X Gamborg B5 基础培养基、30 g/L 蔗糖、20 mM MES、0.25 mg/L GA3、1.67 mg/L BAP、200 µM 乙酰丁香酮组成的感染培养基中, 和 1 mM 二硫苏糖醇 (pH 5.4)。这些板用封口膜（“Parafilm M”VWR 目录号 52858）密封，然后超声处理（Sonicator-VWR 型号 50 T）30 秒。超声处理后，将胚胎轴外植体转移到单层高压灭菌的无菌滤纸（VWR#415/目录号 28320-020）上。用 Micropore 胶带（目录号 1530-0, 3M, St. Paul, MN）密封板，并在暗光（5–10 µE/m 2 /s，冷白荧光灯）下在 21 °C 下孵育 16 小时3天。 共培养后，将每个胚轴的基部包埋在含有 30 g/L 蔗糖、6 g/L 琼脂和 25 mg/L 壮观霉素（S742，PhytoTech Labs）的芽诱导培养基（R7100，PhytoTech Labs）中作为可选试剂和 500 mg/L 头孢噻肟 (GoldBio, St. Louis, MO, USA)，pH 5.7。芽诱导在 26 °C 下进行，光周期为 18 h，光强为 40-70 µE/m 2 /s。在选择培养基中 4-6 周后，将抗壮观霉素的枝条切割并转移到含有 15 g/L 蔗糖、6 g/L 琼脂、10 mg/L 壮观霉素和250 mg/L 头孢噻肟用于进一步的枝条和根系伸长。 |
|
|
