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背景 1 分子生物学的迅速发展，基因组学研究也随之进入后基因组时代。功能基因组学是在研究生物有机体内各种基因功能的基础上，进一步解析所有基因协调发挥作用的机制。 要准确揭示每个基因的功能及它们之间的相互联系，就要进行单个基因和多个基因的突变表型及其时空表达特征的分析。构建饱和基因突变体库是最直接和有效的方法，基因功能的鉴定可以通过对突变体的分析来完成。 在遗传学的研究中，必须要有相应的突变体材料，才能开展相关基因的功能研究工作。由于存在自发突变，所以在自然环境中，也会出现不同表型的突变体。随着基因组测序工作的大规模开展，大量基因组序列信息的获得，依靠自发突变获得的突变体进行基因功能的研究已远远不能满足分子生物学研究的需要。 要高通量地对植物基因进行功能研究，就要开展植物物种的大型突变体库的创制工作。利用已经取得的植物物种的全基因组序列信息，借助于反向遗传学的研究方法，对突变体库进行大规模的高通量筛选，最终得到不同基因的突变体，以实现解释基因组中基因功能的目的。 构建突变体库的意义 2 2.1 突变体库的建立成为进行功能基因组学研究的必要组成部分，也是进行功能基因组学研究获得成功的关键因素。 2.2 突变体库的建立对作物的品种选育、品质改良以及遗传基础的拓宽也有重要意义。通过对突变体的研究，发现一些有利基因。 理化诱变突变体库 3 3.1 理化诱变的方法： 常采用的物理诱变因素有伽玛射线、快中子等。 化学诱变中，常使用的化学诱变剂有DES、EMS等。 理化诱变操作方便，诱变效率高，会产生DNA的点突变、缺失或重排等。目前理化诱变在拟南芥、水稻等突变体库的创建上已得到广泛应用。 对突变体的相关基因进行筛选，一般采用两种办法： （1）设计该基因区段的特异引物，利用PCR扩增方法，进行突变体库的筛选，如果DNA片段的缺失存在于所设计引物的区段内，那么运用PCR所扩增出的产物会出现DNA片段长度的多态性； （2）针对EMS引起的植物基因组单碱基变化，一般利用TILLING技术，将包含目的片段的引物设计出来，进行PCR，以得到扩增产物，在PCR扩增产物中，如果有单碱基突变的存在，可以将突变型DNA扩增片段和野生型变性后再复性，也可以利用变性高效液相色谱（DHPLC）或者识别错配位点的酶来检测这种错配碱基。 3.2 理化诱变的优点： 进行理化诱变时，通常会导致植物基因组中的多位点突变，所以覆盖全基因组需要构建的突变体库不用太大，而且操作过程又比较方便，使得突变体库的构建相对容易一些。 在理化诱变中，不涉及植物遗传转化及植物组织培养等过程，所以也就没有遗传转化和组织培养过程中存在的与基因型相关的限制因素。 3.3 理化诱变的缺点 虽然理化诱变技术较为简单，但其诱变过程却难以控制，往往在一个突变体中，包含了较多的点突变，可能由多个点突变共同作用，才出现了突变表型。而且，经过理化诱变的处理，植物基因组还可能发生DNA大片段的重排或缺失，还可能促使逆转座子的转座，使得对功能基因进行鉴定，会有着更大的困难。 在理化诱变中，所处理的材料一般为植物的种子，而由处理过的种子发育形成的突变体，会出现大量的嵌合体，给研究带来困难。 插入突变体库 4 插入突变体库主要是由插入诱变而构建的突变体库，插入的元件主要是转座子或T-DNA，相应地可创建转座子插入突变体库和T-DNA插入突变体库。一般插入诱变的效率较高，目前已普遍应用于突变体库的构建中，在功能基因组学研究中起到了重要的作用。 转座子插入突变体库由转座子构建的转座子突变体库中，可以利用转座子标签进行插入位点基因的分离和克隆。 在玉米中对转座子的研究最多。目前已利用玉米的转座子标签，克隆出了一些基因，解释了相应基因的功能。主要有Activator/Dissociation(Ac/Ds)、Mutator(Mu)、Enhancer/Suppressor-mutator(En/Spm)转座子系统。 T-DNA插入突变体库由T-DNA插入构建的突变体库称为T-DNA插入突变体库。利用农杆菌进行转化时，通过其中的Ti质粒，使携带外源基因的T-DNA侵染植物，经过复杂的生化过程，穿越核膜，进入到细胞核中，随机地整合到核基因组中。整合到核基因组中的T-DNA能够较稳定地遗传下去。T-DNA插入到基因组的位置不同，会引起不同的基因突变，产生不同表型的突变体。 4.1 插入突变体库的优点： T-DNA一般是单拷贝插入到外源植物基因组中，而以较低的频率进行多拷贝串联重复插入。由于运用T-DNA进行插入诱变方便高效，目前已在植物突变体库的构建中得到大量的应用。在拟南芥中，利用T-DNA标签法克隆了近一半的突变体基因。 在植物T-DNA插入突变体库中，每一转基因单株的发生都是一个独立的事件，因而利用T-DNA插入进行诱变，是高效产生基因突变的方法。T-DNA的序列是已知的，相当于给插入基因标示了一个序列标签，使得可以通过这个标签来分离克隆插入诱变的基因。 4.2 插入突变体库的缺点： 但在其他一些物种中，还没有建立起高效的农杆菌转化体系， 并且农杆菌介导的T-DNA转化过程耗时长， 花费大， 突变体中常会有嵌合体的存在，这些都增加了利用T-DNA在其他物种构建突变体库的难度。 参考文献： [1] Lu X , Liu J , Ren W , et al. Gene-Indexed Mutations in Maize[J]. Molecular Plant, 2018, 11(3):496-504.
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