CRISPR/Cas9是一种极具可塑性的工具，已经席卷了基因编辑领域。虽然Cas9已被广泛用于DNA特定位点的编辑，但在构建Cas9转录激活因子方面也是大有可为。这些载体允许通过将缺乏DNA切割活性的Cas9突变体融合到转录激活结构域来上调几乎全部基因(图1)。
具有已知功能的基因的CRISPR激活具有用于治疗的潜力，因为它可以增加某些基因座的基因表达，从而产生表型的变化。例如，CRISPR激活已被用于通过激活引起分化的基因诱导多能干细胞(Chavez et al., 2015)分化为神经元细胞，并逆转艾滋病毒潜伏期(Bialek et al., 2016)。此外，基于CRISPR的激活可以在环境触发时被诱导。这是通过创造一种分裂的dCas9蛋白质来实现的，当暴露于特定的紫外线波长或化学物质时，该蛋白质可以重新组装(Polstein和Gersbach，2015；蔡澈等人，2015年)。这些类型的CRISPR激活也是可逆的:一旦环境触发离开，基因表达就不再被激活。然而，有几个因素可能会影响你的基因被上调。例如，一般来说，一个基因在自然条件下表达得越多，使用CRISPRa能实现的激活就越少。我们感兴趣的基因可能已经达到激活上限，而目前的Cas9系统无法完成上调。此外，激活实验通常需要相当多的调整，才能知道该系统是否按预期工作。最后，对于每个想要激活的基因，应该准备好测试三四个针对该基因的gRNA，因为导向效力可能有很大的差异。因此，当拥有了一个想要激活的基因的情况下，我们建议使用cDNA过表达载体，而不是进行基于Cas9的激活的所需进行所有故障的排除。Cas9激活剂的最佳用途之一是用于基因筛选。例如，靶向人类基因组中每一个基因的gRNAs可以使用寡文库合成容易且便宜地得到。在Cas9激活剂之前，类似的工具是使用其他DNA结合蛋白制成的，如锌指(ZF)和TAL效应器(TALE)。然而，与这些载体不同的是，Cas9允许通过简单地提供一个新的gRNA，而不是设计一个全新的蛋白质，来轻易改变激活物所靶向的序列。这使得使用Cas9活化剂便宜得多。这种更大规模的激活也允许做探索性研究。例如，CRISPRa可用于通过发现激活时导致癌细胞系细胞死亡的基因来寻找潜在的癌症药物靶点(Gilbert et al., 2014; Behan et al., 2019)。由于能够同时靶向多个基因位点，CRISPRa还可以用于绘制分子路径和遗传相互作用。此外，基于CRISPR的大规模筛选可用于深入了解蛋白质结构和功能(Pan et al., 2018)。由过表达来自给定细胞类型或生物体的编码序列的质粒组成的cDNA文库已经以类似于Cas9激活剂的方式在使用。然而，与gRNAs相比，它们可能难以构建和交付使用。此外，cDNAs不能用于研究顺式调控，并且也不能容易地递送给定基因的适当同种型，因为许多时候，特定细胞类型共有的同种型是未知的或不容易获取的。通过从基因的天然环境中激活，Cas9激活剂有效地解决了这些问题。你可以在实验中使用各种各样的活化剂。我们发现SAM(Konermann et al., 2014)、Suntag (Tanenbaum et al., 2014, Gilber et al, 2014)和VPR (Chavez et al., 2015)是跨多种细胞系(HEK293T、MCF7、U2-OS、Hela、N2A、3T3)和生物体(Chavez et al., 2016)的较优选择。要了解更多关于不同类型的Cas9活化剂，请继续关注下一篇文章。与Cas9切割不同，脱靶效应通常不会被视为Cas9激活剂的问题。考虑到以前的RNA-seq实验结果(Konermann et al., 2014, Chavez et al., 2014, Chavez et al., 2016)，以及Cas9会有一个落在另一个基因启动子上的脱靶位点，从而驱动异常转录的可能性非常低，即脱靶效应不是很大的问题。也就是说，我们通常通过将基因的启动子放入gRNA查找器(如WU-CRISPR (Wong et al., 2015)或sgRNA scorer 2.0 (Chari et al.,2015)中，并选择最接近转录起始位点(TSS)的gRNA。我们建议将guide定位在TSS上游小于200 bp的区域，以获得最佳效果，但大于400 bp的区域也可以获得较好效果。Behan FM, Iorio F, Picco G, Gonçalves E, Beaver CM, Migliardi G, Santos R, Rao Y, Sassi F, Pinnelli M, Ansari R, Harper S, Jackson DA, McRae R, Pooley R, Wilkinson P, van der Meer D, Dow D, Buser-Doepner C, Bertotti A, Trusolino L, Stronach EA, Saez-Rodriguez J, Yusa K, Garnett MJ (2019) Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens. Nature 568:511–516 . https:///10.1038/s41586-019-1103-9Bialek JK, Dunay GA, Voges M, Schäfer C, Spohn M, Stucka R, Hauber J, Lange UC (2016) Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR/Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PLoS ONE 11:e0158294 . https:///10.1371/journal.pone.0158294Chari R, Mali P, Moosburner M, Church GM (2015) Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library-on-library approach. Nat Methods 12:823–826 . https:///10.1038/nmeth.3473Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, Tuttle M, P R Iyer E, Lin S, Kiani S, Guzman CD, Wiegand DJ, T er-Ovanesyan D, Braff JL, Davidsohn N, Housden BE, Perrimon N, Weiss R, Aach J, Collins JJ, Church GM (2015) Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods 12:326–328 . https:///10.1038/nmeth.3312Chavez A, Tuttle M, Pruitt BW, Ewen-Campen B, Chari R, T er-Ovanesyan D, Haque SJ, Cecchi RJ, Kowal EJK, Buchthal J, Housden BE, Perrimon N, Collins JJ, Church G (2016) Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nat Methods 13:563–567 . https:///10.1038/nmeth.3871Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, Villalta JE, Chen Y, Whitehead EH, Guimaraes C, Panning B,Ploegh HL, Bassik MC, Qi LS, Kampmann M, Weissman JS (2014) Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell 159:647–661 . https:///10.1016/j.cell.2014.09.029Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N,Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F (2014) Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature 517:583–588 . https:///10.1038/nature14136Pan J, Meyers RM, Michel BC, Mashtalir N, Sizemore AE, Wells JN, Cassel SH, Vazquez F, Weir BA,Hahn WC, Marsh JA, Tsherniak A, Kadoch C (2018) Interrogation of Mammalian Protein Complex Structure, Function, and Membership Using Genome-Scale Fitness Screens. Cell Systems 6:555-568.e7 . https:///10.1016/j.cels.2018.04.011Polstein LR, Gersbach CA (2015) A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol 11:198–200 . https:///10.1038/nchembio.1753Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD (2014) A Protein-Tagging System for Signal Amplification in Gene Expression and Fluorescence Imaging. Cell 159:635–646 . https:///10.1016/j.cell.2014.09.039Wong N, Liu W, Wang X (2015) WU-CRISPR: characteristics of functional guide RNAs for the CRISPR/Cas9 system. Genome Biol 16:218. https:///10.1186/s13059-015-0784-0Zetsche B, Volz SE, Zhang F (2015) A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol 33:139–142 . https:///10.1038/nbt.3149
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