《自然》黄酮类原花青素 C1 具有治疗活性并延长小鼠的寿命

凝霜飞羽 2022-05-02 发布于广东

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抽象的

与衰老相关的器官功能衰退和与年龄相关的慢性病的风险增加部分是由衰老细胞的积累驱动的，这些细胞会形成衰老相关的分泌表型 (SASP)。在这里，我们表明原花青素 C1 (PCC1) 是葡萄籽提取物 (GSE) 的一种多酚成分，通过其对衰老细胞的作用来延长小鼠的健康和寿命。通过筛选天然产物库，我们发现 GSE 和 PCC1 作为其活性成分之一，对衰老细胞具有特定的作用。在低浓度时，PCC1 似乎抑制 SASP 的形成，而在较高浓度时它可能通过促进活性氧的产生和线粒体功能障碍选择性地杀死衰老细胞。在啮齿动物模型中，PCC1 可在治疗受损的肿瘤微环境中消耗衰老细胞，并在与化疗联合给药时增强治疗效果。对受辐射、植入衰老细胞或自然衰老的老年小鼠间歇性施用 PCC1 可减轻身体功能障碍并延长存活时间。我们将 PCC1 鉴定为具有体内活性和高潜力的天然 senotherapeutic 剂，作为临床干预延迟、减轻或预防与年龄相关的病理的进一步发展。

主要的

衰老是慢性疾病的最大风险因素之一，包括心血管疾病、代谢紊乱、神经退行性疾病和各种恶性肿瘤，这些疾病共同占全球发病率、死亡率和健康成本的大部分1。近年来，在开发治疗个体年龄相关疾病（如 2 型糖尿病、骨质疏松症、骨骼脆弱和血管功能障碍）的特定药物方面取得了相当大的进展。然而，这些药物在控制慢性病发病率和死亡率方面的联合作用一直不大，而且这些疾病往往与多种疾病同时发生，70 岁后患病率呈指数增长2。

通过对一系列物种的研究确定了影响健康寿命和寿命的几个主要因素，并将其定义为衰老机制，可分为九个特征3。在这些基本的衰老机制中，细胞衰老受到了极大的关注，因为它代表了一种可预防或延缓多种衰老合并症的药物过程4。细胞衰老在 1960 年代首次报道，指的是一种细胞状态，涉及基本上不可逆的复制停滞、严重的染色质变化、细胞凋亡抗性和蛋白质合成增加，经常导致促炎细胞因子的过度产生，这一特征被称为 SASP，被认为驱动衰老表型和各种与年龄相关的病理5.对衰老标志物 p16 INK4A呈阳性的衰老细胞的消融可减轻组织退化并延长动物的健康寿命，从而支持衰老细胞在机体衰老6、7中起致病作用的论点。

临床前研究的成功激发了概念验证临床试验的开始，这些试验涉及针对几种人类疾病的抗衰老药物，这些疾病有可能通过选择性药理消除来减少体内衰老细胞的负担8,9,10。自 2015 年首次发现（参考文献11）以来，现在已知有少数合成或小分子抗衰老剂。靶向策略主要基于衰老细胞对细胞凋亡的抵抗机制，这似乎依赖于衰老相关的抗细胞凋亡途径，使衰老细胞存活更长的时间12,13.senolytics 的间歇给药有可能降低患者出现不良状况的风险，最大限度地减少药物的脱靶效应，并防止衰老细胞产生耐药性，这些细胞不会分裂，这是它们与癌细胞不同的特征，因为癌细胞经常获得有利的突变，从而提供对抗癌疗法的抵抗力。然而，大多数报道的抗衰老药物依赖于细胞谱系或细胞类型，或者在体内表现出显着的细胞毒性，因此限制了它们在临床上的潜在用途。

在这项研究中，我们筛选了一个由抗衰老剂组成的天然药物库，并确定了包括 GSE 在内的几个候选药物。进一步分析表明，PCC1是GSE类黄酮的B型三聚体表儿茶素成分，在低浓度下抑制SASP表达和在高浓度下杀死衰老细胞中起主要作用，后者通过诱导细胞凋亡。临床前数据表明，与经典化疗相结合，PCC1 可以显着减小肿瘤大小并延长几种小鼠模型的生存期。因此，PCC1 代表了一类从天然来源中分离出来的新型植物化学抗衰老剂，可延缓衰老并改善与年龄相关的疾病，作为临床医学中潜在的老年保护剂值得进一步探索。

结果

低浓度 GSE 抑制 SASP 表达

为了确定可以有效调节衰老细胞的新化合物，使用由 46 种植物衍生药物（PDMA 库）组成的植物化学库进行了无偏药物筛选。为此，我们采用原代正常人前列腺基质细胞系 PSC27 作为基于细胞的模型。PSC27 主要由成纤维细胞组成，但含有少量非成纤维细胞谱系，包括内皮细胞和平滑肌细胞，PSC27 本身是一种原代细胞系，在暴露于基因毒性化学疗法或电离辐射等应激源后会形成典型的SASP14、15,16,17.我们用预先优化的亚致死剂量的博莱霉素（50 μg ml-1）并观察到衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色增加，5-溴脱氧尿苷掺入减少和7-10天后DNA损伤修复（DDR）病灶升高（补充图1a-c）。我们建立了一个筛选策略来比较单个医药产品对衰老细胞的存活和表达谱的影响（扩展数据图1a）。

衰老清除剂的一个有希望的优势是选择性地诱导衰老细胞的程序性死亡，例如 ABT-263、ABT-737 以及达沙替尼和槲皮素的联合使用11、18、19。我们首先测试了这些老年保护药物对衰老 PSC27 细胞的功效，以证明其作为药物筛选实验细胞模型的潜力。我们的初步数据表明，这些化合物中的每一种都显着耗尽了衰老细胞而不是增殖细胞，因此证实了使用这种基质线进行进一步研究的可行性（扩展数据图1b）。在对 PDMA 文库进行大规模筛选后，我们确定了几种具有选择性杀死培养物中衰老细胞的潜力的化合物（扩展数据图1c-e）。

显示出初步抗衰老作用的药物包括 GSE、槲皮素、非瑟酮、姜黄素和 piperlongumine（扩展数据图1d、e）。槲皮素和非瑟酮具有相似的化学结构，发挥相似的药用效果，都是已知的抗衰老药物11,20,21。姜黄素和 piperlongumine 也是最近发现的具有抗衰老潜力的天然化合物22,23。我们选择专注于 GSE，它仍然是一个很大程度上未被充分开发的资源。在体外条件下，GSE 以 0.1875 μg ml-1的最大效率抑制 SASP （扩展数据图2a），这符合同质性的特性24.较低或较高浓度的 GSE 效果较差，可能是由于细胞毒性增加导致细胞应激反应的诱导（扩展数据图2a）。使用 RNA-seq，我们发现 GSE 处理显着改变了衰老细胞的表达谱，2,644 个基因下调，1,472 个基因上调，每个基因的倍数变化为 2.0（P < 0.01）（扩展数据图2b）。尽管一些与 SASP 无关的基因的表达表现出与典型 SASP 因子相似的趋势（扩展数据图2c），来自我们的基因集富集分析（GSEA）的数据支持SASP分子特征的表达减少或核因子（NF）-κB复合物的激活，这是促炎表型的关键介质（扩展数据图1）。2d,e)。

在衰老细胞中观察到 p65（NF-κB 复合物的主要亚基之一）的核转位，这与其在 SASP 表达14中的功能参与一致（扩展数据图2f）。值得注意的是，这种趋势在低浓度（例如 0.1875 μg ml-1）下基本上被 GSE 拮抗。相反，当 GSE 以较高浓度（例如 3.7500 μg ml-1)，表明衰老细胞在这些治疗条件下的不同反应。DDR 信号的激活，如核部分中 ATM 激酶的磷酸化所证明，以及 C-X-C 基序趋化因子配体 (CXCL)8 的表达，如在细胞质部分中观察到的 SASP 标志因子之一，与 NF 一致-κB 在这些设置中的激活（扩展数据图2f）。

蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示了一个高度活跃的网络，涉及多个因子，在细胞衰老时显着上调，但一旦细胞暴露于 GSE，就会下调（扩展数据图3a）。基因本体分析显示，这些分子在功能上参与生物过程并与通常与 SASP 的分泌性质一致的细胞成分相关（扩展数据图3b，c）。因此，GSE 是一种天然产物，当在特定浓度范围内使用时，它有可能控制衰老细胞 SASP 的促炎特性。尽管 GSE 不是我们基于细胞的测定中唯一具有抗衰老功效的天然产物（扩展数据图1d，e)，我们随后的研究主要集中在 GSE，因为它的老年保护能力显得特别引人注目。

GSE 在高浓度下具有抗衰老活性

鉴于 GSE 作为衰老剂在降低 SASP 方面的功效，我们接下来研究了这种天然产物在更高浓度下通过充当衰老剂杀死衰老细胞的潜力。SA-β-Gal 染色表明衰老细胞在 GSE 浓度为 0.75 μg ml-1时被消除（图1a，b）。在 3.75 μg ml-1GSE 时，达到了 20% 的衰老细胞存活的平台期（图1a，b）。

图 1：GSE 消除衰老细胞能力的表征。

a，SA-β-Gal 阳性对衰老 PSC27 细胞存活的定量。GSE 以增加的浓度应用于培养基。CTRL，控制（增殖）细胞；SEN，衰老细胞；NS，不显着。P值通过单因素方差分析和 Tukey 的多重比较检验计算。b，显示用不同浓度的 GSE 处理 PSC27 细胞后 SA-β-Gal 染色的代表性图像。比例尺，20 μm。数据代表三次独立的实验。DMSO，二甲亚砜。c，用GSE（浓度为0.3750、0.7500、1.8750、3.7500、7.5000和15.0000 μg ml-1 ）处理后对照和衰老PSC27细胞的存活分析，分别）。数据显示为平均值±标准差，并来自三个生物学重复（n = 3 个独立测定）。P值通过双边t检验计算。d ，在用GSE (3.75 μg ml-1)处理对照和衰老PSC27细胞后体外存活力的时间过程测量。数据显示为平均值±标准差，来自三个生物学重复（n = 3 个独立实验）。P值通过双边t检验计算。e，用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶 (PI) 试剂盒和 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色处理后对照和衰老 PSC27 细胞的流式细胞术测量，以确定细胞凋亡的程度。Q1-Q4，四分位数 1-4。f，比较量化用载体或 GSE 处理的对照或衰老群体中的活细胞（Q4，PI-膜联蛋白 V-）和凋亡（Q2 和 Q3，PI+膜联蛋白 V+和 PI-膜联蛋白 V+）细胞百分比3 天（n = 3 次生物学独立测定）。P值通过双边t检验计算。G, 在不同条件下测量 PSC27 细胞中线粒体超氧化物指示剂 MitoSOX Red 的荧光信号。P值通过双边t检验计算。h，高分辨率质谱图显示了执行 HPLC-ESI-QTOF-MS 后 GSE 的总离子色谱图 (TIC) 和基峰色谱图。除非另有说明，否则在培养条件下 GSE 处理后 3 天对细胞进行相关分析。cps，每秒计数。条形图和回归曲线中的数据显示为平均值±标准差，代表三个生物学重复。NS,P > 0.05;*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

源数据

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细胞活力测定显示，从 0.75 μg ml -1的浓度开始，GSE 诱导衰老细胞死亡而不是增殖细胞死亡（图1c）。在 7.50 μg ml-1的浓度下，存活的衰老细胞的百分比下降到大约 10%，而即使在 15.00 μg ml-1GSE（图1c）中使用的最高浓度GSE时，增殖细胞的活力也没有受到影响。我们的细胞分析表明 GSE 对衰老细胞具有显着的选择性和特异性，这是 senolytics 的主要特征。

我们接下来测量了 GSE 在一个时间过程中差异靶向衰老细胞的能力。在用浓度为3.75 μg ml-1的GSE处理后，衰老细胞的活力直到20小时后才显着降低。衰老细胞和对照（增殖细胞）之间的活力差异在 32 小时后达到最大值，这意味着衰老细胞群中对衰老抑制剂的内在抗性存在异质性（图1d）。

由于 GSE 对衰老细胞产生不同的作用，我们分析了 GSE 在诱导细胞凋亡中的功效。流式细胞术显示活力显着降低，而衰老细胞的凋亡而不是增殖细胞的凋亡升高（图1e，f和补充图2a）。线粒体功能障碍和代谢变化是衰老细胞和机体衰老的标志之一，这些事件会导致氧化应激和活性氧 (ROS) 如超氧化物3、25的产生。我们使用线粒体超氧化物指示剂 MitoSOX Red26，以探测细胞间变化，发现GSE促进了衰老细胞中线粒体ROS的产生，但不促进增殖细胞的产生（图1g）。因此，我们的数据与 GSE 通过在体外诱导细胞凋亡和加剧线粒体应激来杀死衰老细胞的模型一致。

以干物质计，葡萄籽占葡萄的 38-52%，是抗氧化剂的丰富来源27。我们应用高压液相色谱 (HPLC) 与配备电喷雾电离 (ESI) 接口的四极飞行时间质谱 (QTOF-MS) 耦合来识别 GSE 的主要成分。我们发现了三大类植物化学物质，包括酚酸、类黄酮（如flavan-3-ol、原花青素）和其他化合物（图1h和补充表1）。其中，一些成分被鉴定为原花青素及其衍生物，据报道它们可以靶向线粒体蛋白并缓解多种慢性疾病28.然而，介导 GSE 的衰老功能的主要成分仍不清楚。

GSE 的 PCC1 成分具有抗衰老活性

据报道，葡萄籽原花青素的生物活性包括减少氧化损伤、抑制炎症和诱导癌细胞凋亡 29、30、31、32。在 GSE 中发现的单个化合物中，PCC1 值得特别注意，因为它被证明可以诱导 DNA 损伤、导致细胞周期停滞和增加检查点激酶的表达33。通过 HPLC-QTOF-MS 对 GSE（一种植物化学剂本身的混合物）进行初步分析（总离子色谱图）的数据表明存在 PCC1，因为 GSE 在特定 MS 峰的谱图与化学纯 PCC1 的色谱图谱相匹配从商业来源获得（图1h和补充图 1）。2b)。

PCC1 显示降低 BCL-2 的水平，但增加调节剂 BAX 的表达以及培养的癌细胞中半胱天冬酶 3 和 9 的活性，因此可能通过诱导细胞凋亡产生抗癌作用33。因此，我们接下来评估了 PCC1 消除培养物中衰老细胞的能力和选择性。数据表明 PCC1 对衰老的基质细胞具有抗衰老作用，从 50 μM 的浓度开始，增殖细胞基本上不受影响（图2a、b和补充表2）。虽然较高浓度导致衰老细胞的存活率较低，阈值约为 200 μM，但 PCC1 在 600 μM 或更高浓度下仅对对照细胞表现出毒性（图2b ））。caspase 3/7 活性的时间过程表明 PCC1 在 12 小时内发挥凋亡作用，在 24 小时达到平台期（图2c）。这一发现在很大程度上与活力测量结果一致（图2d）。由于复制衰竭或衰老 (RS) 或癌基因 (HRASG12V) 过表达 (OIS) 而进入衰老的细胞证实了 PCC1 的衰老特性，这会产生类似于治疗诱导的衰老的应激损伤（图2e，扩展数据图4b-e和补充表2）。总之，结果表明 PCC1 以剂量依赖性方式选择性清除由不同刺激诱导的衰老人类基质细胞，但在适当浓度下使用时对非衰老细胞没有显着影响。

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图 2：PCC1 的抗衰老潜力的表征。

a，通过 SA-β-Gal 染色测量衰老的 PSC27 细胞存活率。以增加的浓度应用 PCC1。P值通过单因素方差分析和 Tukey 的多重比较检验计算。b，博莱霉素在增加 PCC1 浓度下诱导的衰老 PSC27 细胞的存活。c，半胱天冬酶3/7活性的凋亡测定。d，评估PCC1处理后PSC27细胞活力的时程存活曲线。e，SA-β-Gal染色图像。TIS，治疗诱导的衰老（通过博来霉素）。比例尺，20 μm。数据代表三次独立的实验。F, 用膜联蛋白 V-FITC 和 PI 试剂盒处理后的流式细胞术和 DAPI 染色以确定细胞凋亡水平。g,用载体或 PCC1 处理 3 天后存活 (Q4, PI-膜联蛋白 V-) 和凋亡 (Q2 和 Q3, PI+膜联蛋白 V+和 PI-膜联蛋白 V+) 细胞百分比的量化(n = 3 次生物学独立测定）。h，PSC27细胞的免疫荧光染色。RS是在PCC1处理前通过连续传代诱导的。红色，p16INK4a.早期传代 (P10) 的细胞用作阴性对照。ABT-263 (1.25 μM) 作为阳性对照进行了测试。比例尺，20 μm。i，免疫荧光染色统计。j，在泛半胱天冬酶抑制（20 μM QVD-OPh）后 PCC1 诱导的衰老活性。k，人MSC的PD测定。如所示，在实验开始后的第 8 天应用 PCC1。BLEO，博来霉素。对于c,d,k, 数据显示为平均值 ± sd 并且来自三个生物复制 (n = 3 独立测定)。对于b–d、g、i、j中的数据，P值通过双边t检验计算。在c–k的实验中，PCC1 的使用浓度为 100 μM。除非另有说明，否则在 PCC1 处理后 3 天收集样品进行分析。条形图中的数据显示为平均值±标准差，代表三个生物学重复。NS,P > 0.05;*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

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为了实验性地扩展和建立跨细胞谱系的 PCC1 功效，我们用 PCC1 处理人胎肺成纤维细胞 (WI38)、原代人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 和人间充质干细胞 (MSCs)，发现所有这些谱系的衰老细胞都表现出PCC1 对选择性消融的敏感性相似，而它们的非衰老对应物仍然可行（扩展数据图4f-h和补充表3）。我们通过流式细胞术进一步证实了衰老细胞响应 PCC1 诱导细胞凋亡，而增殖细胞在很大程度上不受 PCC1 的影响（图2f，g）。总之，我们的数据表明，PCC1 选择性地消除各种细胞类型中的衰老细胞，并由不同的衰老触发因素引起。

为了可视化 PCC1 对衰老细胞的消耗，我们检查了 p16INK4a的表达，这是一种广泛使用的衰老标志物，在经历 RS 的基质细胞中。PCC1 有效去除 p16 阳性衰老细胞，这些细胞仅出现在晚期传代 PSC27 群体中，其功效与 ABT-263 (1.25 μM) 相似，ABT-263 (1.25 μM) 是一种成熟的合成衰老清除剂18,21(图2h,i）。

为了证实 PCC1 介导的衰老细胞消除主要通过诱导细胞凋亡发生，而不是通过其他形式的程序性细胞死亡，我们用泛半胱天冬酶凋亡抑制剂喹啉-缬氨酰-O-甲基天冬氨酰-(-2,6 -二氟苯氧基）-甲基酮（QVD-OPh）。PCC1 杀死衰老细胞的能力被 QVD-OPh 逆转。因此，PCC1 与 ABT-263 共享其半胱天冬酶依赖性细胞凋亡诱导作为衰老特征（图2j）。用化学抑制剂进行的进一步分析排除了 PCC1 通过铁死亡、焦亡或坏死性凋亡引起的细胞死亡（扩展数据图4i）。

为了评估用基因毒性药物治疗后细胞群倍增 (PD) 的潜力，我们使用了 MSC，即使在暴露于环境压力34后，它也可以自我更新并恢复基于集落的增殖，这可能是由于损伤的异质性，与细胞经历较少损伤大概能够保持自我恢复和重新进入细胞周期的潜力24,35。与在处理后迅速进入生长停滞的博莱霉素损伤细胞不同，用 PCC1 进行衰老后处理显着增强了 MSC 的 PD 能力，尤其是在去除产生 SASP 并具有诱导细胞群内旁分泌衰老潜力的衰老细胞之后（图.2k）。然而，用 PCC1 处理不会影响增殖细胞的 PD，这进一步表明 PCC1 与正常细胞相比对衰老细胞的选择性。

由于 GSE 是一种复杂的植物化学混合物，其许多成分都具有抗氧化和抗炎活性27、36，因此我们研究了 PCC1 是否是 GSE 中参与消耗衰老细胞的主要成分，或者 GSE 中的替代植物化学物质是否有助于其整体抗衰老作用。为此，我们检查了单个植物化学分子对衰老 PSC27 细胞存活的影响。大多数 GSE 成分未能在 PCC1 的剂量范围内表现出抗衰老活性，并且不会导致增殖细胞显着死亡（补充图3和4）。虽然黄酮类槲皮素在我们之前的研究中表现出抗衰老活性，但与天然黄酮11、21共享的特性是“重组 GSE”，由我们的 HPLC-QTOF-MS 数据显示的根据质量百分比混合的主要成分组成（补充表1（请注意，槲皮素仅占 0.9%）但有意排除 PCC1，没有显示与在两种测定中观察到的 PCC1 相似的结果（补充图3和4）。虽然我们不能断定其他成分是否有贡献，但我们的数据清楚地表明 PCC1 是 GSE 衰老作用的主要介质。

PCC1在衰老细胞中诱导线粒体功能障碍

鉴于 PCC1 在选择性诱导衰老细胞死亡方面的显着功效，我们询问了潜在的机制。PCC1 属于类黄酮超家族，可清除自由基、螯合金属并减少氢过氧化物的形成，其抗氧化特性归因于结构中的功能性“-OH”基团及其在类黄酮分子环上的位置27。原花青素的抗氧化能力部分取决于它们的聚合程度，而 PCC1 本质上是一种原花青素表儿茶素三聚体（图3a）。

图 3：PCC1 通过参与促凋亡途径诱导衰老细胞凋亡。

a, 三聚表儿茶素 PCC1 的化学结构。b，热图描绘了在衰老的 PSC27 细胞中显着上调的顶级基因 (50)，但在 PCC1 处理 (50 μM) 后下调。红星，SASP 因素。c，SASP 谱中重要基因组的 GSEA 图。FDR，错误发现率；NES，归一化富集分数。d，与 NF-κB 介导的信号传导相关的重要基因组的 GSEA 图。e，典型SASP相关因子的蛋白质-蛋白质相互作用的NetworkAnalyst图谱在衰老细胞中显着上调，但通过PCC1处理下调。F, 热图显示 BCL-2 家族基因在对照、衰老和 PCC1 处理的衰老细胞中的差异表达。g，暴露于不同试剂的 PSC27 细胞的免疫印迹。检测促凋亡和抗凋亡因子以及DDR信号相关分子的表达。Caspase 3 (t)，总 caspase 3；caspase 3 (c)，切割的 caspase 3；p，磷酸化。β-肌动蛋白和 GAPDH，加载对照。数据代表三次独立的实验。h，在暴露于博来霉素以诱导衰老之前，细胞用三种不同的靶向NOXA或PUMA的短发夹 RNA 感染。7 天后，用 PCC1 (100 μM) 处理细胞 3 天以诱导细胞凋亡。可控硅，争夺。一世,NOXA表达是使用逆转录定量 PCR (RT-qPCR) 确定的。在不存在或存在 10 μM MK2206、10 μM ruxolitinib 或 20 nM BMS-582949 以抑制 AKT、JAK1 和/或 JAK2 或 p38 的活性的情况下，用博莱霉素处理细胞以诱导衰老，然后暴露于 100 μM PCC1 3 天MAPK，分别。j ，使用i中描述的条件对PUMA进行一组类似的 RT-qPCR 表达测定。k–m，在不存在或存在 MK2206 (k)、ruxolitinib (l) 或 BMS-582949 (m ) 的情况下测量 PCC1 处理后的细胞活力)，包括分别抑制 AKT、JAK1 和/或 JAK2 或 p38 MAPK 的酶活性。对于c、d中的数据，P值是通过 Tukey 事后比较的单向 ANOVA 计算的。使用双边t检验或单向方差分析（Dunnett 检验）计算h-m的统计显着性。所有条形图中的数据均显示为平均值±标准差，代表三个生物学重复。NS,P > 0.05;*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

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我们首先分析了 PCC1 对衰老细胞全转录组表达的影响。生物信息学显示，在 PCC1 处理后，基质细胞中有 4,406 个基因显着上调，2,766 个基因下调（补充图5a）。我们观察到大量 SASP 因子，其表达在细胞衰老期间显着上调，但在衰老细胞暴露于 PCC1 时显着下调（图3b）。GSEA分析显示PCC1处理显着抑制了SASP和NF-κB特征（图3c，d）。我们进一步注意到这些因子在衰老过程中上调和在 PCC1 处理后下调出现在顶级差异表达基因列表中的多种相互作用或功能联系，其中大多数通常是分泌因子（图3e）。

为了了解 PCC1 对衰老细胞的选择性，我们进一步评估了转录组表达谱，并注意到 PCC1 诱导了一些 BCL-2 超家族成员的表达变化（图3f）。尽管 DDR 信号在很大程度上不受影响，但观察到 p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的 PCC1 依赖性上调或激活，在这些细胞中发生 caspase 3 切割（图3g ））。尽管 BCL-xL 在衰老细胞中的表达相对于其增殖对照中的表达升高，但 PCC1 处理并未进一步提高其蛋白质水平。其他两个 BCL-2 因子，即 BCL-2 和 BAX 的水平基本保持不变。虽然 NOXA 和 PUMA（仅 BCL-2 同源结构域 3（BH3）的促凋亡亚家族的两个成员）在细胞衰老过程中表现出不同的表达模式，但 PCC1 处理导致两种因子的上调（图3g）。

敲除 BCL-2 促凋亡因子表明 NOXA 和 PUMA 部分介导了 PCC1 的衰老作用（图3h和扩展数据图5a-c）。用 AKT 激酶、Janus 激酶 (JAK)1、JAK2 和 p38 MAPK 信号通路的化学抑制剂处理也表明这些信号通路参与了PMAIP1(NOXA) 和BBC3(PUMA) 的表达以及 PCC1 处理后的衰老细胞凋亡 (图3i )-m)。

由于敲除 NOXA和PUMA仅部分抑制 PCC1 的衰老作用（图3h，k-m），我们研究了导致衰老细胞死亡的其他可能机制。因为原花青素通常会增加细胞活力，减少 ROS 产生并抑制哺乳动物细胞中的氧化应激37,38，我们接下来询问在暴露于 PCC1 的衰老细胞中是否可以观察到类似或抗氧化作用。令人惊讶的是，我们发现情况正好相反，因为衰老的 PSC27 细胞在用 PCC1 处理时显示出升高的 ROS 水平，这与它们的增殖对应物形成对比（图4a和扩展数据图5d，注意来自 2’-7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 探针的信号）。HS-1793 是一种具有清除自由基活性的稳定白藜芦醇类似物39处理，有效地阻止了用 PCC1 处理的衰老细胞中 ROS 的产生（扩展数据图5e、f），而暴露于 PCC1- 后 ROS 水平进一步增加将衰老细胞处理为 CCCP，一种质子载体线粒体解偶联剂40或 ruxotemitide (LTX-315)，一种两亲性阳离子肽，可诱导线粒体外膜41的透化，每种都以对对照细胞无细胞毒性的浓度施用（扩展数据图5e,f）。尽管用 CCCP 或 ruxotemitide 本身处理也导致 ROS 产生增加，但效果通常小于 PCC1 诱导的效果，这表明 PCC1 会引发衰老细胞中的线粒体功能障碍。通过测量衰老细胞的凋亡指数（caspase 3/7 活性），我们发现 PCC1 诱导的效应可以在 PCC1 与每种线粒体破坏物组合时进一步增强，但在与 HS-1793 共同处理时被抑制（扩展数据图.5g).

图 4：PCC1 诱导的细胞凋亡部分是通过线粒体功能障碍介导的。

a，用 DCFH-DA 测量 ROS 水平，DCFH-DA 是一种对细胞氧化还原状态变化敏感的细胞可渗透荧光探针。PCC1处理后1天进行实验。左，代表性图像。比例尺，10 μm。对，统计。DCF，二氯二氢荧光素。b，细胞暴露于不同处理后的免疫印迹。通过在 PCC1 处理后 3 天从细胞质上清液中分离线粒体来分析线粒体和细胞质之间的细胞色素 c 分布。COX IV 是线粒体呼吸链的末端酶和线粒体标志物。C, 时程存活曲线评估 PSC27 细胞在用 PCB2（天然原花青素家族的另一个成员）处理后的活力。数据显示为平均值±标准差，并来自三个生物学重复（n = 3 个独立测定）。d ，以与a中描述的类似方式进行的ROS产生测定，除了细胞暴露于PCB2。比例尺，10 μm。e，ATM、p53和caspase 3在细胞质和细胞核之间的表达和分布的免疫印迹。GAPDH 和核纤层蛋白 A/C，分别加载细胞质和细胞核的对照。C1、PCC1；B2，PCB2。F, 用载体 (DMSO) 或 PCC1 处理细胞后的免疫荧光染色的共聚焦显微镜检查。应用对 p53 或 COX IV 特异的一抗。比例尺，10 μm。g，暴露于不同试剂的 PSC27 细胞的免疫印迹分析。细胞, 细胞质;mito，线粒体。h，JC-1染色分析，指示Δψm的荧光探针。信号测量超过 3 天。绿色荧光表示 JC-1 单体（它们在线粒体膜去极化后出现在细胞质中，表示早期细胞凋亡）。红色荧光表示 JC-1 聚集（位于完整的线粒体上）。左，代表性图像。对，统计。在相关测定中，PCC1 和 PCB2 均以 100 μM 使用。b,e中的数据–g代表三个独立实验。a（右）、d（右）和h（右）中的统计显着性使用双边t检验计算，c中的统计显着性使用单向方差分析（Dunnett 检验）计算。所有条形图中的数据均显示为平均值±标准差，代表三个生物学重复。NS,P > 0.05;*P < 0.05；**P < 0.01。

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细胞色素 c 的释放和线粒体膜破坏是与细胞凋亡相关的细胞内事件，并且通常充当直接的细胞凋亡驱动因素42。我们的数据表明，PCC1 处理增强了细胞色素 c 从线粒体释放到周围的细胞质空间（图4b和扩展数据图5h）。从线粒体释放细胞色素 c 在很大程度上与生化反应一致，例如 PCC1 处理的衰老细胞中的半胱天冬酶活化（图3g）。

原花青素家族的成员表现出广泛的药理特性，包括抗氧化和抗炎症，这与我们在用 PCC1 治疗衰老细胞时观察到的相反。目前的数据促使我们推断 PCC1 的作用是否被其他原花青素复制。原花青素 B2 (PCB2) 是一种具有代表性的黄酮类化合物，以二聚体形式存在，可在培养细胞的氧化应激过程中降低 ROS 水平43。PCB2 未能消除衰老细胞（图4c和补充图3b和4b），既没有增强 ROS 的产生，也没有诱导衰老细胞中细胞色素 c 的线粒体释放（图4d和扩展数据图5i ））。大量p65（RelA）是NF-κB复合物的主要亚基之一，易位至衰老细胞的细胞核（图4e）。尽管 PCB2 处理抵消了 p65 核转位，这与其抗炎能力一致，但 PCC1 并未重现这种效应（图4e）。暴露于 PCC1 的衰老细胞表现出显着的 caspase 3 裂解，而用 PCB2 处理的那些则没有，这进一步区分了这两种原花青素分子的生物活性（图4e）。

作为在功能上控制细胞命运的一个因素，p53 可以通过反式激活促凋亡基因或以不依赖转录的方式通过转位到线粒体来诱导细胞凋亡44。我们观察到细胞衰老时p53的核转位增加，PCC1显着降低了这种模式，但远低于PCB2（图4e，f）。由于 p53 的核排斥是诱导衰老细胞凋亡的关键步骤45，我们进一步评估了 p53 的分布。免疫荧光染色表明，在 PCC1 处理的衰老细胞中，p53 与细胞色素 c 氧化酶亚基 IV (COX IV)（线粒体呼吸电子链中的跨膜蛋白复合物，通常用作线粒体驻留蛋白标记物）的重叠显着增加，表明 p53 的易位增强p53 进入线粒体基质。尽管我们在增殖细胞的线粒体中观察到一些 p53，但 PCC1 并未诱导 p53 蛋白显着或全面流入增殖细胞的线粒体基质（图4f）。然而，在衰老细胞中，p53 水平在细胞核中降低，但在暴露于 PCC1 后在线粒体中增加（图4g）。

线粒体膜电位 (Δψm) 下降是可以通过线粒体介导的内在途径触发细胞凋亡的事件46。我们发现 Δψm 在衰老细胞中显着降低，而增殖细胞在 PCC1 存在下基本不受影响，如 JC-1 探针信号的分布所示（图4h）。因此，PCC1 促进 ROS 生成，触发细胞色素 c 释放并导致衰老细胞中的 Δψm 紊乱，这些事件与线粒体功能障碍和功能驱动细胞凋亡有关。

总之，我们的实验数据表明，衰老细胞受到 PCC1 诱导的细胞凋亡的影响，这一过程部分由NOXA和PUMA上调介导，并与 ROS 产生增强和线粒体功能障碍有关。

PCC1 促进肿瘤消退并降低化疗耐药性

鉴于 PCC1 在体外消除衰老细胞的能力和选择性，我们接下来询问是否可以利用这种药物来干预体内与年龄相关的病理。在临床肿瘤学中，耐药性限制了大多数抗癌治疗的功效，而衰老细胞经常通过在药物损伤的肿瘤微环境 (TME)中形成体内 SASP 15、16、47 而导致治疗耐药性。药物治疗诱导的衰老细胞的消除可最大限度地减少化疗的副作用并防止动物癌症复发48.然而，PCC1 介导的从原发性肿瘤中去除衰老细胞以增强抗癌治疗效果的可行性仍然很大程度上未知。

首先，我们选择将 PSC27 细胞与 PC3 细胞（一种典型的高恶性前列腺癌细胞系）以预先优化的比例 (1:4)14混合来构建组织重组体。然后将细胞皮下植入患有非肥胖糖尿病和严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）的小鼠的后腹。在 8 周结束时测量动物的肿瘤，并获取组织用于病理学评估。与包含 PC3 癌细胞和幼稚 PSC27 基质细胞的肿瘤相比，由 PC3 细胞和衰老的 PSC27 细胞组成的异种移植物的体积显着增加，证实了衰老细胞的肿瘤生长促进作用（扩展数据图6a）。

为了模拟临床情况，我们通过实验设计了一种结合基因毒性疗法和/或抗衰老药物的临床前治疗方案（图5a）。皮下植入两周后，当观察到体内肿瘤稳定摄取时，在第 3、5 和 7 周的第 1 天向动物提供单剂量的米托蒽醌（MIT，一种化疗药物）或安慰剂，直至结束8 周方案（扩展数据图6b）。与安慰剂治疗组相比，MIT 给药显着延缓了肿瘤生长，验证了 MIT 作为化学治疗剂的功效（肿瘤大小减少 44.0%）（图5b ））。值得注意的是，虽然 PCC1 本身的给药不会导致肿瘤缩小，但用 MIT 治疗，然后给予 PCC1（在第一次 MIT 给药后 2 周通过腹膜内（ip）注射 20 mg/kg，然后每两周给药一次）显着增强了肿瘤消退（55.2与单独使用 MIT 相比，肿瘤体积减少 %；与安慰剂治疗相比，肿瘤体积减少 74.9%）（图5b）。

图 5：受损 TME 中 PCC1 的 Senolysis 降低了 SASP 赋予的癌症抗性。

a，临床前治疗方案的示意图。在皮下植入和体内摄取组织重组体后两周，NOD-SCID 雄性小鼠在由几个周期组成的节拍时间表中接受单一（单一）或联合（双重）药剂。BLI，生物发光成像。b，肿瘤末端体积的统计分析。将PC3细胞单独或与PSC27细胞一起异种移植到动物的后胁。c，SA-β-Gal染色对体内衰老的比较评价。杀死动物后新鲜解剖肿瘤并加工成冷冻切片用于组织学染色。比例尺，200 μm。d，小提琴图描绘了肿瘤组织中 SA-β-Gal 染色的比较统计数据。e, 在从肿瘤中分离的基质细胞中几种典型 SASP 因子的体内表达的转录分析。来自异种移植基质细胞和癌细胞的动物组织接受激光捕获显微切割支持的分离和后续处理。数据代表三个生物学重复（每组n = 10 只动物）。数据集显示为盒须图，其中一个盒子从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，中位数显示为中间的一条线，胡须表示最小值和最大值。f，基质细胞中 SASP 转录物的分析。对应于每个因素的信号被标准化为来自载体处理组的信号。注p16INK4a也称为CDKN2A和p21CIP1也称为CDKN1A。g ，如a、b所述收集的生物样本中DNA损伤细胞和凋亡细胞的统计测量。值表示为通过免疫组织化学 (IHC) 阳性染色的细胞百分比，该细胞具有对组蛋白 γH2AX 或半胱天冬酶 3（切割）特异的抗体。对于b,d–g,P值是通过双边t检验计算的。h，治疗方案结束时 caspase 3（切割，CC3）的代表性 IHC 图像。比例尺，100 μm。一世, 晚期大块疾病发展后杀死的小鼠的比较存活率。存活时间从重组组织注射到动物死亡计算。MS，中位生存期。P值通过双边对数秩（Mantel-Cox）检验计算。c、h中的数据代表三个独立实验。所有条形图中的数据均显示为平均值±标准差，代表三个生物学重复。

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我们接下来测试了这些动物的肿瘤病灶中是否发生了细胞衰老。不出所料，麻省理工学院的给药诱导了肿瘤组织中大量衰老细胞的出现。然而，将 PCC1 输送到这些化疗处理的动物会耗尽大部分衰老细胞（图5c，d）。激光捕获显微切割和转录分析表明 SASP 因子的表达显着增加，包括IL6、CXCL8、SPINK1、WNT16B（也称为WNT16）、GM-CSF（也称为CSF2）、MMP3和IL1A，在化疗治疗的动物中伴随着编码衰老标志物 p16INK4a的基因上调的趋势（图5e和扩展数据图6c）。这些变化主要在基质细胞中观察到，而不是在邻近的癌细胞中观察到，这意味着残留癌细胞可能重新增殖，这些细胞经常在治疗受损的 TME 中产生获得性抗性。然而，在施用 PCC1 后，SASP 相关的变化在很大程度上被逆转，正如转录分析和 RNA-seq 所暗示的（图5f和扩展数据图6d）。

为了研究 MIT 治疗小鼠中 SASP 表达的机制，我们在第一剂 GSE 给药后 7 天，即耐药菌落形成之前的时间点，解剖了用这两种药物治疗的动物的肿瘤。与安慰剂治疗相比，MIT 给药增加了 DNA 损伤和细胞凋亡，而单独使用 PCC1 治疗没有（图5g）。然而，当麻省理工学院治疗的动物共同给予 PCC1 时，DNA 损伤和细胞凋亡显着增加，这意味着接受化疗和抗衰老药物的动物的细胞毒性增强。作为支持证据，当 PCC1 与 MIT 一起给药时，我们观察到 caspase 3 裂解升高，这是细胞凋亡的典型标志（图5h）。

接下来，我们通过比较不同动物组随时间的存活率来评估肿瘤进展的后果。在这个临床前队列中，监测动物的肿瘤生长情况，一旦肿瘤负荷突出（大小 ≥ 2,000 mm 3），就认为已经出现大块疾病，这是以前研究中采用的方法14,49。接受 MIT-PCC1 组合治疗的小鼠显示出最长的中位生存期，比单独用 MIT 治疗的组存活时间至少长 48.1%（图5i ），绿色与蓝色）。然而，单独的 PCC1 治疗只能略微延长生存期。我们的数据表明单独施用 PCC1 既不会改变肿瘤生长也不会促进动物存活，而 PCC1 与 MIT 的共同施用具有显着的协同作用。

值得注意的是，在这些研究中进行的治疗似乎被动物很好地耐受，因为没有观察到尿素、肌酐或肝酶水平或体重的显着扰动（扩展数据图6e、f）。更重要的是，在本研究中以优化剂量施用的化学治疗剂和老年保护剂不会显着干扰免疫系统的完整性或关键器官的组织稳态，即使在免疫功能正常的小鼠中也是如此（补充图6a-c）。这些结果支持抗衰老药物与常规化疗联合有可能增强肿瘤反应而不引起严重全身毒性的基本原理。

PCC1 治疗导致的衰老细胞去除可缓解身体功能障碍

即使是少量的衰老细胞也会在幼年动物中诱发身体功能障碍50。我们询问 PCC1 是否在体内选择性地杀死衰老细胞，从而防止身体功能障碍。为了解决这个问题，我们将组成型表达荧光素酶（LUC +）的对照和衰老小鼠胚胎成纤维细胞（MEF，每侧0.5×106 个细胞）平行植入同基因野生型（WT）小鼠中。植入后立即用 PCC1（通过 ip 注射以 20 mg/kg）或载体（乙醇-聚乙二醇 400-Phosal 50 丙二醇（PG）在 10:30:60）治疗 7 天（图6a）。我们发现植入衰老细胞并用 PCC1 处理的小鼠的发光信号强度显着低于载体处理的同窝小鼠，尽管在移植 LUC+对照细胞的小鼠治疗后没有观察到差异（图6b，c），证实了 PCC1 在体内的抗衰老功效。

图 6：PCC1 介导的衰老防止身体功能障碍和缓解病理症状。

a，5 个月大的 C57BL/6J 雄性小鼠的细胞移植和身体功能测试的实验程序示意图。b，显示小鼠最后一次治疗后 2 天体内荧光素酶活性的代表性图像。比例尺，20 毫米。c，移植细胞的发光相对于载体处理动物的平均信号的百分比。d-f，5 个月大 C57BL/6J 雄性小鼠的最大步行速度（相对于基线）（d）、悬挂耐力（e）和握力（f）的测量，最后一次治疗后 1 个月进行测试.G, 移植和身体功能测量的实验设计示意图。h-j，测量28 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠（最后一次治疗后 2 周）的最大步行速度（相对于基线）（h）、悬挂耐力（i）和握力（j ）。k , 植入 0.5 × 106对照 MEF 细胞并用载体（CTRL-载体）处理的 17 个月大的动物和植入 0.5 × 106的小鼠的一年存活曲线用载体 (SEN-vehicle) 或 PCC1 (SEN-PCC1) 处理的衰老 MEF 细胞。红色箭头，细胞植入（第 528 天）或生存测量结束（第 890 天）。P值通过双边对数秩（Mantel-Cox）检验计算。l，在植入衰老细胞和用载体或PCC1治疗后，疾病负担（左）和肿瘤负担（右）（显示为四分位间距的中位数）的比较量化。m，接受植入细胞并用载体或 PCC1 治疗的动物的死亡原因。对于d–f,h–j，数据显示为箱须图，其中箱线从第 25 个百分位延伸到第 75 个百分位，中位数显示为中间的一条线，胡须表示最小值和最大值。对于c–f,h–j,P值是通过双边t检验计算的。动物数量，对于c，每组n = 5，对于d–j 每组n = 10，对于k，n = 27，对于l，m，n = 13。NS,P > 0.05;*P < 0.05;**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

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我们接下来研究了使用 PCC1 杀死植入的衰老细胞是否可以减轻病理事件，特别是身体功能障碍。在植入衰老细胞 1 周后用 PCC1 治疗年轻动物可防止最大步行速度 (RotaRod)、悬挂耐力（悬挂测试）和握力（握力米）下降，在载体处理另一组小鼠后 1 个月内观察到变化衰老细胞，与 PCC1 减少身体功能障碍的潜力一致（图6d-f）。PCC1 给药还预防了在衰老细胞植入后 5 周在动物中发生的身体功能障碍（图6g ））。在携带衰老细胞的小鼠中，与载体治疗相比，单次 5 天的 PCC1 治疗可改善身体机能（图6h-j）。值得注意的是，PCC1 治疗后 2 周可检测到改善，甚至持续数月（扩展数据图7a、b）。在 PCC1 给药的这两个时间点（即与衰老细胞植入后 5 周相比），PCC1 的有益效果似乎相当。数据表明 PCC1 给药的时间表可能是灵活的，表明其潜在的临床可行性。由于植物种子来源的原花青素通常具有 <12 小时的消除半衰期51,52单疗程 PCC1 治疗后身体功能的持续改善避免了使用衰老清除剂持续治疗的需要，进一步暗示 PCC1 的活性足以避免衰老细胞诱导的身体功能障碍。

接下来，我们试图评估衰老细胞的影响或消除它们对中年动物的益处。为此，我们使用了 17 个月大的 C57BL/6J 小鼠，这些小鼠植入了对照或衰老的 MEF。值得注意的是，携带衰老细胞并在次年接受载体治疗的动物的存活率显着低于接受 PCC1 治疗的动物，死亡风险高出 2.4 倍（风险比，P = 0.0172）（图6k）。然而，用载体治疗的小鼠和用PCC1治疗的小鼠之间的疾病负担、死亡时的肿瘤负担和死亡原因没有显着差异（图6l，m）。这些数据表明，少数衰老细胞可能通过一般过程（例如加速衰老进程）影响生存，而不是通过引起任何特定病理或一些个体状况。增加衰老细胞负担会导致身体机能障碍，这种趋势与中年死亡率相关，但可以通过使用 PCC1 等抗衰老药物来推迟。

PCC1 维持身体机能并延长老年小鼠的生存期

在各种病理生理情况下，Senolytics 会消耗不同组织和器官中的衰老细胞，其中大多数与衰老有关53。为了进一步检查 PCC1 对生物体衰老细胞和生物体衰老的影响，我们选择了两种独立的体内衰老动物模型，包括接受治疗的小鼠和自然衰老的小鼠。首先，我们通过将 WT 小鼠暴露于亚致死剂量（5 Gy）的全身照射（WBI）来诱导细胞衰老，然后用 PCC1（通过 ip 注射 20 mg/kg）或载体（乙醇-聚乙烯）进行老年保护治疗。乙二醇 400–Phosal 50 PG 在 10:30:60）（每周一次）（图7a）。值得注意的是，经历过WBI的动物表现出异常的身体外观，包括明显的白发，然而，这在很大程度上被PCC1给药所逆转（图7b，c）。在这些动物体内诱导SA-β-Gal阳性衰老细胞，心脏和肺组织中染色阳性增加证明了这一点（图7d，e）。然而，当我们通过腹腔注射 PCC1 处理时，解剖组织中 SA-β-Gal 阳性细胞的百分比显着降低，这与 WBI 后阶段的载体处理小鼠不同（图7f，g）。与载体处理相比，PCC1 处理还降低了衰老标志物和关键 SASP 因子子集的表达（图7h ））。总之，数据表明 PCC1 可以在小鼠体内条件下有效地消耗 SA-β-Gal 阳性细胞，控制 SASP 表达并最大限度地减少衰老细胞负担。

图 7：PCC1 治疗减轻了暴露于 WBI 的动物的身体功能障碍。

a，经历WBI和身体功能测试的小鼠的实验程序示意图。b，C57BL/6J 雄性小鼠的全身快照比较，分别是幼稚、暴露于 WBI 然后进行载体处理或暴露于 WBI 并用 PCC1 处理。c，在临床前条件下描述的动物的笼内照片。d，未经处理（幼稚）和 WBI 处理过的接受载体或 PCC1 处理的小鼠心脏组织的 SA-β-Gal 染色的代表性图像。比例尺，200 μm。e ，如d中所述的小鼠肺组织 SA-β-Gal 染色的代表性图像。比例尺，200 μm。F，在d中检查的动物心脏组织的 SA-β-Gal 染色的比较统计。g ，e中检查的动物肺组织SA-β-Gal染色的比较统计。h ，从在a中描述的条件下处理的动物收集的组织中转录水平上 SASP 表达的定量测量。i,j,实验小鼠在跑步机上的跑步距离 (i) 和握力 (j ) 的测量。对于f–j，P值是通过双边t检验计算的。ķ, 暴露于 WBI 并每周用载体或 PCC1 治疗的 C57BL/6J 小鼠的 Kaplan-Meier 生存分析，幼稚小鼠作为未治疗的对照。CI，置信区间；HR，风险比；DFI，无病间隔。P值通过双边对数秩（Mantel-Cox）检验计算。条形图中的数据显示为平均值±标准差，代表三个独立实验。NS,P > 0.05;*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

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然后，我们评估了临床前治疗对小鼠身体参数的影响。正如预期的那样，WBI 显着损害了运动能力和肌肉力量，如通过车辆组中的跑步机和握力测定法测量的（图7i，j）。相比之下，PCC1 管理提供了实质性的好处，恢复了这些能力。更重要的是，PCC1 治疗提高了存活率（图7k）。我们的研究结果表明，PCC1 诱导的 SA-β-Gal 阳性衰老细胞的消除可能是一种有效的策略，可以缓解与衰老相关的身体退化，并降低由环境压力因素（如细胞毒疗法）引发的过早衰老环境中的死亡率。

接下来，我们试图确定衰老细胞对自然衰老动物身体功能的影响。为此，我们用载体（乙醇-聚乙二醇 400-Phosal 50 PG，在 10:30:60）或 PCC1（20 mg/kg 腹腔注射）（每 2 周一次）治疗正常 20 个月大的 WT 小鼠4个月（图8a）。组织学评估显示，老年动物的肾脏、肝脏、肺和前列腺中 SA-β-Gal 阳性衰老细胞的百分比显着升高，这被 PCC1 治疗逆转（图8b、c和扩展数据图8a-f）。物理测试结果表明，与用载体处理的动物相比，PCC1 通过提高动物的最大步行速度、悬挂耐力、握力、跑步机耐力、日常活动和梁平衡性能来减轻身体功能障碍（图8d-i），身体在 PCC1 处理的小鼠中，体重和食物摄入量基本保持不变（扩展数据图8g，h）。值得注意的是，与载体治疗组相比，用 PCC1 治疗的老年小鼠的肺等组织中 SASP 的表达显着降低（图8j），这种模式与治疗的人基质组织分泌较少的 SASP 因子一致与 PCC1（图5f）。

图 8：间歇性 PCC1 给药可延长老年小鼠的健康和寿命。

a，20 月龄 C57BL/6J 雄性小鼠每 2 周（每两周一次）用 PCC1 治疗 4 个月的体格检查示意图。b，用载体或 PCC1 处理的年轻和老年小鼠肾脏的 SA-β-Gal 染色的代表性图像。比例尺，200 μm。c，SA-β-Gal染色的定量，如b中所述。数据代表平均值 ± sdd–h、最大步行速度（相对于基线）（d）、悬挂耐力（e）、握力（f）、跑步机耐力（g）和日常活动（h ）的量化) 20 个月大的 C57BL/6J 雄性小鼠在 4 个月的治疗后。i，量化通过平衡木所需的时间。连接每只动物治疗前后的数据点，以便直接比较治疗效果。j，从 6 个月大的未处理 (6M)、24 个月大的载体处理 (24M-载体) 和 24 个月大的 PCC1 处理的小鼠 (24M-PCC1) 收集的肺组织中 SASP 表达的定量转录谱分析）。数据显示为平均值±标准差，并来自三个生物学重复（n = 3 个独立测定）。k，24-27 月龄小鼠（两性）寿命分析的示意图。l,m, 治疗后生存率 (l) 和C57BL/6J 动物从 24-27 个月开始每两周用 PCC1 (n = 91; 48 雄性, 43 雌性) 或载体 (n = 80; 42 雄性, 38 雌性)治疗的全生命生存 (m) 曲线年龄。n，在生命的最后 2 个月（每组n= 10 只小鼠）和两组中寿命最长的小鼠（前 20 只）的平均最大步行速度和悬挂耐力。o，死亡时的疾病负担和肿瘤负担。对于两性，每只手臂n = 60 只小鼠。对于男性， PCC1 为n = 31，车辆为n = 33。对于女性， PCC1 为n = 29，车辆为n = 27。为了c-h,j,n = 3 次生物学独立分析。数据显示为盒须图，其中一个盒子从第 25 个百分位数延伸到第 75 个百分位数，中间显示为一条线，而须线表示最小值和最大值 (d–h,n) 或平均值±标准差 (o)。未配对的双尾t检验 (c–j,n,o) 和 Cox 比例风险回归模型 (l,m) 用于确定统计显着性。

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为了确定消除衰老细胞以延长 WT 小鼠剩余寿命的潜力，我们在非常年老时开始进行 PCC1 治疗（图8k）。从 24-27 个月大（大致相当于人类 75-90 岁）开始接受 PCC1 给药（每 2 周或每两周一次）的小鼠治疗后中位寿命延长 64.2%（或总体延长 9.4%）寿命）和较低的死亡风险（65.0%，P < 0.0001）比载体治疗组（图8l，m）。这些数据表明，PCC1 可以显着降低老年小鼠与年龄相关的死亡风险。

我们接下来询问老年动物死亡率的降低是否以增加晚年发病率为代价。我们每月测量用 PCC1 或载体治疗的实验小鼠的身体机能，直至死亡。尽管 PCC1 处理的小鼠的剩余寿命更长，但生命最后 2 个月的身体机能并未显着低于载体处理的小鼠（图8n）。尸检后，PCC1 处理和载体处理的小鼠之间几种与年龄相关的病理、肿瘤负荷和死亡原因的发生率没有显着差异（图8o和扩展数据图9a、b）。然而，SASP 在实体器官中的表达减少，这在很大程度上与白细胞介素 (IL)-6、集落刺激因子 (CSF)2 和单核细胞趋化蛋白 (MCP)1 等代表性 SASP 标志物循环水平的下降相一致在外周血中（扩展数据图9c-f）。我们还观察到外周血 CD3+T 细胞中 SASP 的表达降低（扩展数据图9g），这是一种在人类衰老过程中 p16INK4a表达显着增加的细胞谱系54.此外，PCC1 治疗降低了肝组织中的氧化应激，这可以通过脂质过氧化产物 4-羟基壬烯醛 (HNE) 的加合物减少和还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比例增加来证明（扩展数据图9h，i），与黄酮类化合物的一般特性一致，黄酮类化合物通过对抗自由基和参与抗氧化防御系统55、56发挥抗氧化活性。

总而言之，抗衰老剂 PCC1 是一种源自 GSE 的植物化学成分（或者，在较低丰度的情况下，源自天然产品，如肉桂、可可、苹果皮和松树皮的提取物），可以减轻衰老细胞和可能的其他细胞的负担发展一种促炎表型，本质上依赖于促生存衰老相关的抗凋亡途径，并增加治疗后的寿命，而不会导致小鼠发病率升高。我们在此提供原理证明证据，即使在晚年使用，这种治疗方式也具有显着延缓与年龄相关的功能障碍、减少与年龄相关的疾病和改善健康状况的显着潜力，从而为改善健康状况提供了新途径未来老年医学的健康和寿命。

讨论

衰老本质上是一个不可避免的过程，它会逐渐导致几乎所有生物体的功能衰退。细胞衰老是一种永久性生长停滞状态，最近已成为衰老的标志和驱动因素3,57。随着时间的推移，衰老细胞会在衰老的组织中积累，并导致越来越多的病症58。清除早衰或自然衰老小鼠的衰老细胞可延长健康寿命、延长寿命并抑制与年龄相关的疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、骨关节炎和神经退行性疾病 59、60、61、62.与年龄相关的研究的最新进展促使人们寻找可以选择性靶向衰老细胞的药物，特别是一类新的老年保护剂，称为 senolytics 或不太激进的 senomorphics。迄今为止，已经报道了少数抗衰老药物，包括达沙替尼和槲皮素、非瑟酮、哌柏隆胺、热休克蛋白 (HSP)90 抑制剂和 BCL-2 家族抑制剂，如 ABT-263 (navitoclax) 和 ABT-737 (refs.11,12,13,18,19,21,22）。其中，BCL-2 抑制剂是使用最广泛的抗衰老药物，尽管最初是作为淋巴瘤的治疗药物开发的。ABT-737 靶向 BCL-2、BCL-xL 和 BCL-w，但溶解度和口服生物利用度低。对于体内使用更有效，ABT-263 主要抑制 BCL-2 和 BCL-xL，而它经常引起血小板减少症。鉴于一些抗衰老化合物的显着副作用，需要鉴定具有抗衰老活性但细胞毒性降低的新化合物。在这项研究中，我们筛选了一个主要由天然产物组成的基于 PDMA 的药物库，旨在确定可以广泛靶向衰老细胞的新药物，并具有最佳的体内功效和安全性。因此，我们将 PCC1（一种源自天然来源的植物化学剂）鉴定为广谱抗衰老化合物。作为一个特殊的优势，当以低浓度使用时，PCC1 也可以作为同种异型剂以最小化 SASP 的表达。PCC1 的这种有利特征确实在很大程度上类似于 GSE，它可以产生同态和衰老效应。

遗传和药理学策略证明了消除衰老细胞以延缓衰老和控制疾病的一系列好处。细胞衰老可由多种刺激触发，从致癌激活、基因毒性应激到炎症反应和复制衰竭。几种化合物被确定为广谱抗衰老剂，而其他化合物仅对某种类型的衰老细胞具有选择性。特异性的差异意味着对senolytics的个体选择，这主要取决于它们的预期临床用途。最近的一项研究表明，哇巴因是一种属于强心苷家族的天然化合物，作为一种衰老清除剂，可用于消除衰老细胞和癌症治疗，后者通过双重作用机制实现63.在这项工作中，我们发现 PCC1 作为另一种新的、天然的和有效的抗衰老剂，它选择性地和特异性地诱导衰老细胞的凋亡，但对增殖细胞的细胞毒性有限64。值得注意的是，在较低浓度下，PCC1 会抑制 SASP 表达，这是一些植物来源的黄酮类化合物（如芹菜素和山柰酚）共有的特性，它们可以作为同形体来限制衰老细胞对年龄相关疾病的影响 65、66。尽管很少有研究揭示了这种天然药物靶向衰老细胞的双重机制，但最近合成的槲皮素表面功能化的 Fe3O4纳米粒子通过增强 AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 活性67在人成纤维细胞中表现出抗衰老和抗衰老的潜力。

PCC1 达到抗衰老作用的机制似乎很复杂，需要进一步研究。我们的数据表明，PCC1 损害线粒体的功能完整性，损害 Δψm，导致自由基如 ROS 的产生增加，并导致衰老细胞而非增殖细胞中的细胞色素 c 释放。这种特异性的一个可能原因是衰老细胞倾向于形成去极化的质膜并且 H+浓度增加（参考文献64)，这一特性可能使它们更容易受到 PCC1 的作用。值得注意的是，这些改变伴随着促凋亡因子的表达上调，特别是 NOXA 和 PUMA，这些事件也严重促进了衰老细胞的凋亡。在原花青素家族中，已知其成员来源于flavan-3-ol分子的聚合并以低聚物或聚合物的形式存在28, PCC1 似乎在功能上是独一无二的。我们的实验数据表明 PCC1（三聚体）和其他原花青素（其中大部分确实是单体或二聚体，例如 PCB2）之间存在显着差异。由于我们没有全面分析原花青素家族成员，分子中单体的数量是否决定其抗衰老潜力仍然是一个开放但有趣的问题，其潜在机制值得未来继续研究。

细胞衰老本身是一个高度异质的过程，取决于不同的细胞起源和环境刺激68。PCC1 的主要特征之一是它能够有效清除各种细胞类型和应激源中的衰老细胞，包括复制、癌基因、辐射和化学疗法。在这项研究中，我们比较了 PCC1 与其他报道的抗衰老药物对人体基质细胞、成纤维细胞、HUVEC 和 MSC（组织微环境中的主要细胞类型）的影响。据报道，ABT-263 可消除衰老的人类胚胎成纤维细胞 ( HEF) 和 HUVEC ，但对人类前脂肪细胞几乎没有影响12、18.达沙替尼和槲皮素的联合使用可以以剂量依赖性方式消耗所有三种类型的衰老细胞，但对增殖细胞有毒性11,69,70。Fisetin 是另一种被报道为抗衰老剂的天然类黄酮，仅在高浓度时对衰老的 HEF 和前脂肪细胞显示出适度的影响20、21。相比之下，PCC1 有可能克服这些限制，包括细胞类型依赖性、非衰老细胞的高毒性和对衰老细胞的低效率。尽管单独使用时，槲皮素（GSE 中的另一种黄酮类化合物）本身对衰老的基质细胞具有细胞毒性，但其功效通常低于 PCC1（比较图2a、c和补充图。3n和4n)。与许多报道的抗衰老药物（如 ABT-263、达沙替尼、槲皮素和非瑟酮）相比，PCC1 具有卓越的抗衰老活性，对更广泛的细胞类型具有高特异性和高效率，并且可以靶向由几种主要类型的衰老诱导剂产生的衰老细胞。

我们发现PCC1在体内条件下对衰老细胞发挥凋亡诱导作用。PCC1 有效地消除了治疗诱导的衰老细胞并减少了实体器官中的衰老标志物，突出了其在体内的有效性。在这项研究中，我们还用 PCC1 治疗了自然衰老的小鼠，并测试了它对衰老细胞、慢性炎症和身体功能的影响。首先，如 GSEA 分析所示，PCC1 处理耗尽了多个组织中的衰老细胞并减少了 SASP 相关特征。其次，PCC1 可以抑制老年肝脏和肾脏中 SASP 相关基因的表达，并减少血液中的慢性低度炎症。第三，PCC1 减轻了老年小鼠受损的运动功能、平衡、疲劳运动、肌肉力量和自发探索。最重要的是，与初始预处理条件相比，PCC1 治疗组的 RotaRod 和梁平衡测试性能有所改善。总的来说，植物化学化合物 PCC1 选择性地靶向组织微环境中的衰老细胞，并在自然衰老的小鼠中产生显着的生物学效应。

与化学合成的对应物相似，天然来源的原花青素具有抗炎、抗关节炎、抗过敏和抗癌活性，清除氧自由基并抑制辐射诱导的过氧化活性36,71。作为一种从植物材料中分离出来的表儿茶素三聚体，最显着的是从葡萄籽中分离出来的，PCC1 被证明可以在慢性病理状况下提供健康益处72.然而，彻底评估 PCC1 在体内的毒理学作用对于潜在的临床应用至关重要。我们的数据显示，高浓度（20 mg/kg）和高频 PCC1（每两周一次）治疗没有明显的全身毒性。总之，我们的研究证明了老年保护策略的优越性和相对安全性，该策略选择性地针对多种细胞类型的衰老或治疗损伤组织中的衰老细胞。然而，体内 PCC1 浓度可能因器官而异，并取决于给药剂量、药效学和药代动力学，并且局部浓度不足以在某些组织类型中达到衰老作用。在这种情况下，

总而言之，我们的研究为延长健康寿命和延长寿命以及使用源自天然来源并具有显着功效的衰老治疗剂（具有衰老和衰老潜能）治疗与年龄相关的疾病开辟了一条新途径。在我们的临床前试验中证明的 PCC1 潜在的抗衰老作用为 PCC1 的进一步转化和临床开发提供了良好的支持，总体目标是实现更长寿和更健康的生活。

方法

临床前动物研究

所有实验动物程序均经中国科学院上海营养与健康研究所机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准，所有动物均按照机构 IACUC 定义的动物实验指南处理。

细胞系、体外培养和慢病毒

人原代前列腺基质细胞系 PSC27 由 P. Nelson (Fred Hutchinson Cancer Research Center) 友情提供，并在补充有 10% FCS、非必需氨基酸、胰岛素、地塞米松的 PSC 完全培养基 (80% MCDB131 (Thermo Fisher Scientific) 中培养、转铁蛋白、硒和 20% AmnioMAX（Thermo Fisher Scientific））如前所述15。人胎肺成纤维细胞系 WI38 和 HUVEC 系购自 ATCC（分别为 CCL-75 和 PCS-100-010），并按照供应商的建议分别保存在 DMEM 和 F-12K 培养基中。MSC 系来源于人脐静脉组织，并在含有 10 μg ml-1重组人胰岛素的 MSC 完全培养基中培养，据报道73.所有细胞系的微生物污染检测均为阴性，并通过 STR 检测进行常规验证。

根据制造商的说明，使用 Lipofectamine 2000 和包装试剂盒 (Thermal Scientific) 生产慢病毒颗粒。使用嘌呤霉素(1 μg ml -1)选择感染了具有嘌呤霉素抗性基因的病毒的PSC27细胞3天。

细胞处理和分析

基质细胞生长至 60-80% 汇合（对照）并用博来霉素（50 μg ml-1，MedChemExpress）处理 12 小时。处理后，细胞用 PBS 冲洗两次，并在培养基中保持 7-10 天。或者，细胞连续传代以诱导复制衰竭作为RS或用编码全长HRASG12V的构建体慢病毒感染并用嘌呤霉素（1μg ml-1）选择3天并维持7天直至衰老（OIS）。

根据先前报道的四类计数策略，通过对 γH2AX 或 p53-BP1 病灶进行免疫染色来评估 DNA 损伤15。使用 CellProfiler (http://www.) 选择随机场来量化 DDR 病灶。对于具有特定需求的实验，HS-1793 (TargetMol)、CCCP (TargetMol) 和 ruxotemitide (LTX325) (Selleckchem) 分别以 10 μM、10 μM 和 50 μg ml-1的浓度使用。对于克隆形成测定，细胞以 1 × 10 3接种在用化学品处理之前，每盘细胞在 10 毫米培养皿中放置 24 小时。处理后7-10天将细胞固定在2%多聚甲醛中，用PBS轻轻洗涤，立即用50%甲醇中的10%结晶紫染色。用 PBS 去除多余的染料，并对板拍照。通过计数每个培养皿的单个菌落来量化菌落形成。

细胞活力测定

将衰老或对照细胞接种到 96 孔板的孔中，然后用载体（0.1% DMSO 或 PBS）或天然产物库试剂（在补充表5中列出）处理，每孔 5,000 个细胞以三种浓度（1、5和 10 μg ml-1用于未知分子量的药剂；或 1、5 和 10 μM（对于已知分子量的试剂）连续三天。用 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 消化培养物并收集在含有 2% FBS 的 PBS 中，通过基于细胞的 MTS 测定法 (Promega) 测量存活率。在额外浓度的 30 天处理中进一步筛选出最佳候选药物。将 MSC (P5-P10) 以每孔 30,000 个细胞的密度接种到六孔板中。具有不同候选试剂的培养基每隔一天更换一次。通过确定用具有治疗能力的药剂处理的 MSCs 的相对增殖能力来量化 PD 潜力，并且允许从培养基中撤出博来霉素后具有恢复潜力的细胞进行扩展以进行 PD 测量。

使用膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡测定试剂盒（Beyotime）评估细胞凋亡。简而言之，在使用 Beckman 流式细胞仪（Beckman，CytoFLEX LX）进行分选之前，依次将细胞与膜联蛋白 V-FITC 和 PI 一起温育。以恒定流速分析活细胞（PI-细胞），并使用以下公式计算用载体处理的对照细胞的百分比：对照百分比 = (N药物Nc-1) × 100，其中N药物和Nc代表 PI 的绝对数量-活的药物处理或载体处理的细胞，分别。为每种测试药物构建剂量反应曲线，并使用概率分析74计算半数最大抑制浓度。

动物的辐射

动物被安置在一个特定的无病原体动物设施中，环境温度为 22-25°C，湿度为 50%，在 12 小时的明暗循环下，自由获取食物并随意喂食。为了诱导体内衰老，将 8-12 周龄的 C57BL/6J 小鼠（雄性，南京模型动物中心）暴露于亚致死剂量（5 Gy）的 WBI。八周后，连续四周每周一次给动物注射20mg/kg PCC1 ip或载体。最后一次注射后 24 小时处死小鼠。收集小鼠组织用于 RNA 提取、石蜡包埋用于免疫组织学或冷冻在 OCT 溶液中用于冷冻切片和 SA-β-Gal 染色。用于所有实验的小鼠被随机分配到对照组或治疗组。在整个研究过程中使用了两种性别。

动物辐射实验程序经中国科学院上海营养与健康研究所IACUC批准，所有动物均按照IACUC机构制定的动物实验指南处理。

化疗方案

6-8 周龄的 NOD-SCID 小鼠（雄性，南京模型动物中心）按照上海生命科学研究所的动物指南进行饲养和饲养。为了建立小鼠肿瘤异种移植物，将人前列腺基质细胞（PSC27 细胞）和癌上皮细胞（PC3 或 PC3-Luc）以 1:4 的比例混合，每个体外重组体在皮下注射前包含 1.25 × 106 个总细胞如前所述的植入14,47.两周后，小鼠被随机分组并接受临床前治疗。单独用 MIT (0.2 mg/kg)、单独的 PCC1 (20 mg/kg) 或 MIT 与 PCC1 治疗动物。MIT 从第 3 周开始每两周通过 ip 注射给药，如先前报道的那样，在整个方案中总共有三个 2 周周期16,17。PCC1 在 MIT 第一剂后 2 周通过 ip 注射递送，然后每两周给予一次，在整个方案中总共给药两剂。

在肿瘤异种移植后第 8 周结束时处死小鼠。从第 4 周开始和动物解剖后，每两周测量一次原发性肿瘤，并使用以下公式从肿瘤长度 (l) 和宽度 (w ) 测量和计算近似椭圆体肿瘤体积 (V) ：V = (π × 6-1) × ((l + w) × 2-1)3.将切除的肿瘤新鲜速冻或固定在 10% 缓冲福尔马林中，随后作为福尔马林固定和石蜡包埋切片进行 IHC 染色。每周对动物称重，每半周检查一次肿瘤生长情况。当肿瘤负荷在后侧突出（肿瘤体积 ≥ 2,000 mm3）时，认为存在大块疾病。当治疗组中的十只小鼠中至少有五只出现大块疾病时，该组的中位生存期被认为已达到。在整个方案中，如果超过最大阈值（任何尺寸≥15 mm），则不允许肿瘤进一步生长，并根据动物护理和使用方案立即处死小鼠。

或者使用稳定表达萤火虫荧光素酶的 PC3-Luc 细胞发出的生物发光来评估小鼠中的肿瘤生长和转移。Xenogen IVIS 成像仪（Caliper Life Sciences）用于记录异氟醚麻醉动物的可见光谱中的生物发光，每次皮下新鲜注射底物D-荧光素（150 mg/kg，BioVision）用于基于成像的肿瘤监测.

化疗程序经中国科学院上海营养与健康研究所 IACUC 批准，所有动物均按照 IACUC 机构定义的动物实验指南进行治疗。

衰老细胞清除和寿命研究

对于与年龄相关的研究，将 WT C57BL/6J 雄性小鼠饲养在 22-25°C 的特定无病原体设施中，光照周期为 12 小时至 12 小时（08:00 至 20 时点亮： 00) 可自由获取食物（标准小鼠饮食，LabDiet 5053）和随意提供的水。实验程序经中国科学院上海营养与健康研究所 IACUC 批准，所有动物均按照 IACUC 定义的动物实验指南进行处理。

小鼠按体重从低到高排序，并根据相似的体重选择成对的小鼠。使用随机数发生器将对照细胞或衰老细胞移植治疗分配给每只其他小鼠，将干预小鼠分配给另一种治疗，以使移植对照细胞和衰老细胞的小鼠按体重匹配。在上海营养与健康研究所动物设施驯化后，将 5 个月大的小鼠皮下移植 MEFs (0.5 × 106每侧细胞）并立即用载体或 PCC1（在 10:30:60，20 mg/kg 的乙醇-聚乙二醇 400-Phosal 50 PG 中制备，20 mg/kg）处理 1 周（每 3 天 ip 注射一次），然后进行生物发光成像测定.在大约 25 周龄的生物发光成像后 1 个月进行身体功能测试。第一次死亡发生在最后一次身体功能测试后大约 3 个月。对于接受细胞移植的治疗延迟小鼠，在细胞移植后 5 周进行第一波身体功能测试。然后用载体处理动物 5 天（对于具有对照细胞的那些作为第一组）或载体或 PCC1 处理 5 天（对于具有衰老细胞的那些，分别作为第二和第三组）（ip每种情况下每 5 天连续注射一次）。将小鼠维持 2 周，之后进行第二波身体功能测定。对于中年研究，17 个月大的 C57BL/6J 小鼠被植入对照或衰老 MEF 细胞，并接受载体或 PCC1 治疗。每两周进行一次给药，并在细胞植入后的 1 年内测量动物的存活率。

对于自然衰老的 senolytic 研究，使用未经移植的 20 个月大的 WT C57BL/6J 小鼠（雄性），并根据其体重进行分类，并随机分配至载体或 PCC1 治疗。在 24 个月大时进行物理测试之前，动物每 2 周以间歇方式治疗一次，持续 4 个月。对于与高龄延长寿命有关的抗衰老试验，我们使用了非常年老的动物。从 24-27 个月大（相当于人类 75-90 岁）开始，小鼠（男女两性）每 2 周（每两周）通过口服管饲法（20 mg/kg）用载体或 PCC1 治疗一次，持续 3 次连续多日。在研究期间，一些老鼠被从原来的笼子中移出，以尽量减少单个笼子的压力。在每种情况下，选择RotaRod（TSE Systems）和悬挂测试分别用于每月测量最大速度和悬挂耐力，因为这些测试被认为是敏感且无创的。如果小鼠表现出以下一种以上的迹象，则对小鼠实施安乐死并记为死亡：（1）不能喝水或吃东西，（2）即使受到刺激也不愿移动，（3）体重迅速减轻，（4）严重平衡(5) 出血或溃疡性肿瘤。没有老鼠因打架、意外死亡或皮炎而丢失。Cox 比例风险模型用于生存分析。(2) 即使受到刺激也不愿移动，(3) 体重迅速减轻，(4) 严重的平衡障碍或 (5) 出血或肿瘤溃疡。没有老鼠因打架、意外死亡或皮炎而丢失。Cox 比例风险模型用于生存分析。(2) 即使受到刺激也不愿移动，(3) 体重迅速减轻，(4) 严重的平衡障碍或 (5) 出血或肿瘤溃疡。没有老鼠因打架、意外死亡或皮炎而丢失。Cox 比例风险模型用于生存分析。

尸检病理检查

每天检查动物笼子，将死老鼠从笼子里取出。24小时内，打开尸体（腹腔、胸腔和颅骨），分别在4%多聚甲醛中保存至少7天，排除腐烂或破碎的尸体。在评估程序之后，将保存的尸体交给病理学家进行盲法检查。简而言之，评估了肿瘤负荷（每只小鼠中不同类型肿瘤的总和）、疾病负荷（每只小鼠主要器官中不同组织病理学变化的总和）、每种病变的严重程度和炎症（淋巴细胞浸润）。

生物发光成像

实验小鼠在 200 µl PBS 中 ip 注射 3 mgD-荧光素（钾盐，BioVision）。通过吸入异氟醚麻醉小鼠，并根据制造商的说明使用 Xenogen IVIS 200 系统（Caliper Life Sciences）获取生物发光图像。

身体机能评估

所有体格检查均在最后一剂抗衰老治疗后至少 5 天进行。使用加速RotaRod系统（TSE Systems）测量最大步行速度。在第 1 天、第 2 天和第 3 天，小鼠在 RotaRod 上以 4、6 和 8 rpm 的速度训练 3 天，持续 200 秒。在测试日，将小鼠放在 RotaRod 上，以 4 rpm 的转速启动在 5 分钟的间隔内从 4 转加速到 40 转。当鼠标从 RotaRod 上掉下来时，速度会被记录下来，结果是三到四次试验的平均值，并归一化为基线速度。对在前 2 个月内接受过训练的小鼠不重复训练。使用握力计（哥伦布仪器公司）测定前肢握力 (N)，结果取十次试验的平均值。为了测量握力，鼠标通过尾巴轻轻摆动，使其前肢接触杆。鼠标本能地抓住横杆并水平向后拉，施加张力。当张力变得太大时，鼠标释放杆。对于悬挂测试，将小鼠放置在距衬垫表面 35 厘米的金属丝（2 毫米厚）上，而动物只能用前肢抓住金属丝。将悬挂时间标准化为体重，作为悬挂时间（s）×体重（g），结果取自每只小鼠的两次或三次试验的平均值。综合实验动物监测系统（CLAMS，Columbus Instruments）用于监测 24 小时期间（12 小时光照和 12 小时黑暗）的日常活动和食物摄入。CLAMS 系统配备有 Oxymax 开路热量计系统 (Columbus Instruments)。-1持续 2 分钟，然后进展到 7 m min-1持续 2 分钟，然后 9 m min-1持续 1 分钟。测试当天，小鼠在跑步机上以5 m min-1的初始速度跑2 min，然后每2 min增加2 m min-1的速度，直至小鼠筋疲力尽。记录鼠标从 RotaRod 上落下的速度，并取 3 次试验的平均值。疲惫被定义为尽管有轻微的电击刺激和机械刺激，但仍无法回到跑步机上。记录距离，并使用以下公式计算总功 (kJ)：质量 (kg) × g(9.8 m s-2) × 距离 (m) × sin (5°)。

综合实验动物监测系统

在每组8-10 只小鼠的子集中，在24小时内（12 小时光照和12 小时黑暗）使用配备 Oxymax 开路热量计系统（哥伦布仪器）的 CLAMS。总结动态、饲养和总活动，并分析进食条件下的光照和黑暗时期。VO2和VCO2值用于计算呼吸交换率和VO2。呼吸交换比值用于确定基础代谢率（以 kcal h-1/ kg 为单位）。

SA-β-Gal 组织测定和组织学评估

对于 SA-β-Gal 染色，冷冻切片在 37°C 下干燥 20-30 分钟，然后在室温下固定 15 分钟。冷冻切片用 PBS 洗涤 3 次，并与 SA-β-Gal 染色溶液 (Beyotime) 在 37°C 下孵育过夜。SA-β-Gal染色完成后，切片用伊红染色1-2分钟，流水冲洗1分钟，1%酸性醇分化10-20秒，再次流水冲洗1分钟。切片在增加浓度的酒精中脱水并在二甲苯中清除。干燥后，在明场显微镜下检查样品。

使用 ImageJ 软件 (NIH) 对用 SA-β-Gal 染色的冷冻前列腺、肺、肝和肾切片进行定量，以测量 SA-β-Gal+面积。总面积通过伊红阳性面积进行量化，而 SA-β-Gal+细胞的相对数量使用 SA-β-Gal+面积除以总面积计算。为了统计肺的SA-β-Gal+面积，随机选择肺区域进行拍照，避免对较大的肺血管和气管进行分析。对于肝脏SA-β-Gal阳性区域的统计分析，随机选择区域进行拍照。用于 SA-β-Gal +的统计分析肾区域，随机选择肾皮质区域进行拍照。每个组织测量 10-18 个区域。

对于内源性酸性β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色，冷冻肾脏和唾液腺切片在37°C下干燥20-30分钟，然后在室温下固定在β-Gal染色固定液中15分钟。冷冻切片用 PBS 洗涤 3 次，并与 β-Gal 染色溶液 (Beyotime) 在 37°C 下孵育过夜。随后的步骤类似于常规 SA-β-Gal 染色方案的步骤。

对于 IHC 分析，福尔马林固定的石蜡包埋组织块被切成切片（7 µm 厚），然后进行脱蜡和水合。在 95 °C 的柠檬酸盐缓冲液（0.01 M，pH 6.0）中回收抗原 10 分钟，然后在室温下用封闭缓冲液（山羊血清，1:60 在 0.1% BSA 的 PBS 中）处理切片 60 分钟。样品在室温下进一步与抗生物素蛋白-生物素（Vector Laboratories）一起孵育 15 分钟。在与生物素化的二抗 (Vector Laboratories) 孵育 30 分钟之前，切片在 4°C 下用一抗染色过夜。最后，应用荧光素标记的亲和素 DCS（Vector Laboratories）20 分钟。IHC 染色由病理学家使用 BOND RX 全自动研究染色机 (Leica) 进行。使用表位检索溶液 1（柠檬酸盐，徕卡）检索载玻片 20 分钟，并在蛋白质块（Dako）中孵育 5 分钟。一抗在背景降低稀释剂 (Dako) 中稀释如下：抗 p16墨水4A（兔，单克隆，Abcam，ab108349）在 1:600，抗切割半胱天冬酶 3（兔，多克隆，Cell Signaling，9661L）在 1:200 和抗 F4/80（大鼠，单克隆，Abcam，ab90247）在 1 ：500，但抗 CD68 抗体（小鼠、单克隆、Dako、M0876）除外，它在 Bond Diluent (Leica) 中以 1:200 稀释。所有一抗在背景降低稀释剂 (Dako) 中稀释并孵育 15 分钟，并使用聚合物精制检测系统 (Leica)。该系统包括过氧化氢酶块、后初级和聚合物试剂、DAB 和苏木精步骤。通过将载玻片在来自 Bond Polymer Refine 检测系统的 DAB 和 DAB 缓冲液（1:19 混合物）中孵育 10 分钟来实现免疫染色的可视化。载玻片用施密特苏木精复染 5 分钟，然后用 1× Bond 洗涤缓冲液和蒸馏水冲洗几次。随后将载玻片用增加浓度的乙醇脱水并用二甲苯清除，然后安装在基于二甲苯的 VECTASHIELD 培养基（Vector Laboratories）中。使用 LSM 780 Zeiss 共聚焦显微镜进行成像。

使用血液测试进行体内细胞毒性评估

对于常规血液检查，从每只动物采集100μl新鲜血液并立即与EDTA混合。用 Celltac Alpha MEK-6400 系列血液分析仪（Nihon Kohden）分析血样。对于血清生化分析，收集血样并在室温下凝固 2 小时或在 4°C 下凝固过夜。然后将样品离心（1,000g，10 分钟）以获得血清。用化学分析仪（Mindray）对约 50 μl 血清的等分试样进行肌酐、尿素、碱性磷酸酶和丙氨酸转氨酶的分析。如先前报道的，在 VetTest 8008 化学分析仪 (IDEXX) 上使用干载玻片技术评估血红蛋白、白细胞、淋巴细胞和血小板的循环水平47。

所有动物实验均按照 NIH 实验动物护理和使用指南（国家科学院出版社，2011 年）和 ARRIVE 指南进行，并经中国科学院上海营养与健康研究所 IACUC 批准。对于每个临床前方案，监测动物的状况，包括超敏反应（体温变化、呼吸改变和毛皮褶皱）、体重、死亡率和行为变化（即食欲不振和痛苦），并根据以下情况进行适当处置相关指南定义的个体病理严重程度。

脂质过氧化的测量

如前所述75使用 OxiSelect HNE 加合物竞争性 ELISA 试剂盒（Cell Biolabs）在小鼠肝脏中测量在 RIPA 缓冲液中制备的肝裂解物中 HNE 蛋白加合物的水平。

谷胱甘肽水平的检查

制备和分析固定在 5% 磺基水杨酸中的小鼠肝脏，使用如前所述75的谷胱甘肽检测试剂盒 (Cayman Chemical) 确定还原 (GSH) 和氧化 (GSSG) 谷胱甘肽的浓度。使用酶标仪在 405 nm 波长处测量样品吸光度，并获得每个测试组织样品的 GSH:GSSG 比率。

统计分析

除非另有说明，数字中的数据表示为平均值±标准差，统计显着性由未配对的双尾学生t确定-test（比较两组），单向方差分析或双向方差分析（使用 Tukey 事后比较比较两个以上的组），Pearson 相关系数检验，Kruskal-Wallis 对数秩检验，Wilcoxon-Mann-Whitney 检验或使用自定义参数启动的 GraphPad Prism 8.3 的 Fisher 精确测试。用SPSS软件进行Cox比例风险回归模型和多变量Cox比例风险模型分析。在大多数实验和结果评估中，研究人员对分配不知情。我们使用基线体重将小鼠分配到实验组，以实现组间相似的体重，因此仅在与体重匹配的组内进行随机化。

为了确定样本量，我们将类型 1 误差 (α) 和功效 (1- β) 的值设置为在统计上足够：分别为 0.05 和 0.8076。然后，我们根据我们测量的最小效应确定n 。如果所需的样本量太大，我们选择重新评估目标或更严格地控制实验条件以减少方差。对于所有统计测试，P值 <0.05 被认为是显着的，P值在整篇文章中呈现如下：NS，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参阅与本文链接的自然研究报告摘要。

数据可用性

本文提供了源数据。支持本文中的情节和本研究的其他发现的数据可根据合理要求从相应的作者处获得。本研究中产生的 RNA-seq 数据分别以登录代码 GSE156301、GSE164012 和 GSE178376 存放在 Gene Expression Omnibus 数据库中。

参考

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