 导语 在本研究中，数据集是从GEO数据库下载的。之后，进行生信分析以选择差异基因（DEGs）。结合铁死亡相关基因（FRG），最终筛选并验证了五个Hub基因TP53、MAPK1、STAT3、HMOX1和PTGS2。 1. 差异FRGs和差异LNCRNA的鉴定 为了研究非肿瘤动脉粥样硬化斑块中差异FRG，从FerrDb中提取了149个FRG，FerrDb是一个与铁死亡相关的调节因子、标志物和疾病的数据库。通过GSE97210的差异分析，与正常内膜相比，4017个lncRNA和6754个基因在动脉粥样硬化斑块中显着差异表达（图 1A、B）。取DEGs和FRGs的交集后，共有59个差异表达的FRGs被定义为DE-FRGs（图 1C）。将59个DE-FRG的表达可视化（图 1D）。  图1 DE-FRGs和DE-LNCRNA的鉴定 2. 基因集富集生信分析 为了比较两组之间的不同通路，随后进行了GSEA富集生信分析。Toll 样受体通路、NOD 样受体通路、转化生长因子β（TGF-β）信号通路、Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活剂（STAT）信号通路、细胞周期、血管平滑肌收缩和细胞溶质DNA 传感通路在动脉粥样硬化斑块中显着富集（图 2）。  图2 GSEA富集生信分析 3. DEG和DE-FRG的功能富集分析 对两组DEGs进行GO和KEGG通路富集生信分析，富集散点图中显示了前20个结果。基于GO富集生信分析，DEGs在相关过程中显着富集，例如 IκB 激酶/NF-κB 信号的正调节和自噬的调节（图 3A）。对 KEGG通路生信分析的研究主要表明这些DEG主要富集在TGF-β信号通路、趋化因子信号通路和血管平滑肌收缩等等通路上（图 3B）。此外，对DE-FRGs进行了GO富集生信分析，结果表明DE-FRGs参与了铁的转运、自噬和Toll样通路的负调控（图3C）。正如预期的那样，这些DE-FRG在铁死亡、线粒体自噬和自噬中显着富集，如KEGG通路生信分析所示（图 3D）。  图3 DEG和DE-FRG的GO和KEGG通路富集分析 4. 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建和可视化 为了研究每个DE-FRG之间的相互作用，使用STING数据库和Cytoscape建立对基因进行蛋白质-蛋白质相互作用网络构建和可视化。DE-FRG的PPI网络，包括54个节点和190条边（图 4A）。根据使用MCODE算法计算的分数，PPI网络分为两个簇（图 4B）。第一个簇由九个基因（TP53，CD44，STAT3，CAV1，TLR4，IFNG，MAPK1和PTGS2）组成，而第二个簇由六个基因组成（LAMP2，NQO1，SQSTM1，ATG13，HMOX1和ATF4）。随后，选取基于MNC、度数和EPC算法生信分析的前5个相交基因作为Hub基因，包括TP53、MAPK1、STAT3、HMOX1和PTGS2。（图4C）。  图4 鉴定5个Hub基因 5. 识别Hub基因与线粒体功能的关系 由于铁死亡总是伴随着线粒体功能障碍，所以选择分析Hub基因与MFRG之间的关系。在1262个MFRG中，505个基因最终被归类为DE-MFRG。共有210个DE-MFRG上调，295个下调。Pearson的相关性分析表明，大多数DE-MFRG与中心FRG高度相关，无论是正的还是负的。 6. 动脉粥样硬化斑块中枢系基因表达的验证 为了找出Hub基因是否在其他类型的动脉粥样硬化斑块中差异表达，选择另外三个微阵列数据集（GSE28829、GSE125771 和 GSE41571）进行分析。在早期和晚期斑块之间共鉴定出320个DEG，在低位和高度钙化斑块之间共鉴定出34个，在破裂和稳定的斑块之间共鉴定出1431个（图 5A–C）。在5个Hub基因中，只有HMOX1在晚期和破裂的动脉粥样硬化斑块中持续上调，这表明更高水平的HMOX1表达可以预测更严重的动脉粥样硬化斑块。HMOX1在高度钙化的动脉粥样硬化斑块中也高度表达，尽管没有统计学意义。为了确定动脉粥样硬化斑块中五个顶级Hub基因的表达，生成了AS的临床前模型。与对照组相比，在喂食西方饮食的小鼠中观察到更明显的动脉粥样硬化斑块和脂质积累。正如预期的那样，HMOX1和PTGS2在西方饮食（图 6）。然而，两组之间在MAPK1，TP53和STAT3中没有看到差异。  图5 验证Hub基因在不同动脉粥样硬化斑块中的表达  图6 动脉粥样硬化斑块中表达的五个中心基因 7. ceRNA 网络的构建 基于竞争性内源性RNA假说，构建了lncRNA-miRNA-mRNA竞争性内源性RNA （ceRNA）网络，以探索 lncRNA在动脉粥样硬化斑块中充当miRNA海绵的功能（图 7）。共表达的上调lncRNA和中枢FRG对与预测的miRNA整合到上调的 ceRNA 网络中。该ceRNA网络包含1439个lncRNA节点、184个miRNA节点、5 个Hub基因节点和20292条边。  图7 ceRNA网络的构建 小结 总之，作者在非肿瘤AS的发展中鉴定了五个铁死亡相关基因TP53，MAPK1，STAT3，HMOX1和PTGS2。然而，关于铁死亡和AS的研究仍处于婴儿期。更多的研究将揭示铁死亡的有限分子机制，从而为铁死亡在AS以及非肿瘤疾病的预防和治疗中提供更多证据。这项研究为铁死亡和AS提供了新的见解。
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