【原】ELISPOT技术｜疫苗免疫效果评价的有效工具

01  原理
 

      淋巴细胞受到抗原刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被ELISPOT板底PVDF膜上（预包被的）特异性单抗捕获。
      去除细胞后，被捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合，其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记点亲和素结合，加底物显色后，PVDF膜上出现紫红色或褐色的斑点表明细胞产生了细胞因子。
       通过酶联免疫分析仪（Elispot reader）对斑点进行自动计数和分析。

优点

（1）灵敏度更高：在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。灵敏度比传统Elisa方法高2-3个数量级。

（2）在单细胞水平对抗体分泌细胞（ASC）及细胞因子（CK）分泌细胞进行检测，活细胞功能检测。

（3）操作简便经济，可以进行高通量筛选:只需要少量细胞，例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。

（4）直观、可信度高:一个阳性细胞一个斑点，斑点数量代表分泌细胞因子的细胞数量多少，斑点大小代表该细胞分泌细胞因子水平的多少。

（5）经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能，这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样。如果试验牵涉全国乃至全球多个临床试验机构，病人血样可冻存、运输到到核心实验室进行检测。

（6）操作简便，16h即可出结果

ELISPOT vs ELISA
 

02  应用介绍

应用领域
·免疫学基础研究

·化合物药物筛选，表位肽筛选

·疫苗研究：
      评价疫苗的细胞免疫水平。

·抗肿瘤免疫：
      已广泛用于抗原特异性细胞毒性T细胞的检测。分析和评价从传染病病人PBMC中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。

·感染性疾病研究：
      例如ELISPOT方法用于结核感染的临床诊断。

·自身免疫病研究：
      调整机体免疫调节功能，对自身免疫病的治疗提供更有效的措施。

·移植免疫研究：
      移植中排斥反应的预测。

·过敏研究：
      参与过敏机制的细胞因子研究，如IL-4。

·辅助临床：
      患者治疗前后，抗原特异性细胞免疫应答水平的检测，可有效的辅助评估治疗效果，对于治疗和用药提供重要的参考信息。通过细胞因子表达谱，辅助评估患者所处的免疫阶段（急性期、平稳期、耐受期、恢复期），有针对的用药，同时评估各种药物对手观者的治疗效果，远优于盲目治疗。

不同的搭载平台——AID明场与荧光ELISPOT读板仪
   

03  ELISPOT在疫苗研发中的应用
·ELISPOT是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的有效方法。

·公认标准：国际上普遍采用ELISPOT方法监测HIV疫苗研究中的免疫应答反应，在国际艾滋病疫苗行动计划中，采用ELISPOT法对T细胞功能进行评价。
 

（1）疫苗研发和动物实验
  ·细菌/病毒 抗原表位筛选，鉴定免疫原性。
  ·不同免疫途径，不同佐剂，不同疫苗株的免疫效果评价。
  ·疫苗的细胞免疫效果评价（通过检测T细胞分泌的针对该抗原的特异性细胞因子）或体液免疫效果评价（通过检测B细胞分泌的针对该抗原的特异性抗体）。

（2）疫苗临床试验
  ·评价疫苗抗原的免疫应答：与保护作用有关的特定免疫原诱导的免疫应答的检测，包括细胞免疫应答水平（细胞因子的分泌）和体液免疫应答水平（抗体水平）（一般在1-3期临床实验中）。

（3）疫苗生产过程中的质控
  ·鉴定不同批次间疫苗的细胞免疫效果和体液免疫效果是否一致稳定。

AID ELISPOT分析仪 部分疫苗案例

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