 导语 通过将机器学习和生信分析应用于发现和验证队列，作者在这里展示了非肿瘤COVID-19患者可以在入院时被分类为不同的免疫表型。这些免疫类型预测随后的临床进展和结果。这种免疫类型可以指导实用生物标志物的开发，也可以指导更个性化的治疗。 1. 通过机器学习在急性COVID-19疾病中识别出不同的免疫类型 在这项研究中，作者选择在临床严重程度方面采取无偏见的方法，首先定义非肿瘤COVID-19患者的免疫类型，然后检查这些是否与临床严重程度和进展有关。在入院时，作者通过机器学习和生信分析测量了非肿瘤COVID-19患者（鹿特丹队列）血清中具有促炎、抗炎或抗病毒活性的特定细胞因子模块。作者将这些血清细胞因子与宿主适应性抗体反应相结合，并使用无监督分层聚类应用机器学习来识别捕获对SARS-CoV-2感染的先天和适应性反应的免疫表型。重要的是，作者没有使用临床严重程度作为聚类变量。使用这种方法，作者在急性感染的非肿瘤COVID-19患者中确定了三种不同的免疫类型（BRI、EXI、LAI）（图 1A）。为了验证这些免疫类型，作者将相同的机器学习方法应用于巴塞罗那队列进行生信分析（图 1B）。主成分生信分析（PCA）显示巴塞罗那队列数据的测量与鹿特丹数据非常匹配（图 1C）。来自巴塞罗那队列的测量值的独立无监督层次聚类始终显示将患者分类为三种不同的免疫类型 BRI、EXI 和 LAI，它们表现出与鹿特丹队列中发现的相似的细胞因子和抗体特征（图 1A、B ）。  图1 急性COVID-19患者的三种不同的免疫类型 作者进一步测试了免疫型的稳健性，通过对数据集进行交叉验证生信分析，从预测角度估计分层准确性。作者使用从5%、10%、15%、20% 和 25% 增加测试百分比，并使用150次迭代。后者的中位数精度分别为0.83、0.80、0.80、0.80、0.81，这表明模型预测略微取决于训练集的大小。这三种免疫类型的特征在于不同的血清细胞因子谱和抗SARS-CoV-2抗体反应（图 2）。由于该CE认证的ELISA系统允许检测NC特异性IgM、Ig和IgA同种型，因此测量了抗SARS-CoV-核衣壳蛋白（NC）抗体，这可以揭示同种型特异性差异。与健康对照相比，所有三种免疫型都具有增加的促炎细胞因子（图 2A），显示出它们之间的进一步显着差异。免疫型BRI的特征是低促炎、抗病毒和抗炎细胞因子和正常的TGFβ1水平（图 2A）。BRI表现出强大的IgM、IgG和IgA抗SARS-CoV-2 NC抗体（图 1A、B和2B）。相比之下，EXI具有更多的促炎特征、低IFNα和正常TGFβ1（图 2A）。免疫型EXI还与IgM、IgG和IgA抗SARS-CoV-2抗体相关（图 1A、B和2B）。免疫型LAI表现出与前两种不同的特征，其特征是存在强烈的IFNα 反应、减少的TGFβ1（图 2A）和非常低的抗体免疫（图 1A、B和2B）。与其他两种免疫类型相比，EXI中的促炎细胞因子显着更高（图 2A）。  图2 COVID-19免疫类型具有不同的细胞因子和抗SARS-CoV-2抗体水平 正如预期的那样，作者发现抗SARS-CoV-2 IgM、IgG和IgA抗体彼此密切相关（图 2C）。与抗体最强的细胞因子相关性与IFNα呈负相关（图 2C）。这可能表明抗体减少了病毒载量，从而减少了IFNα，或者相反，高IFNα水平延迟或抑制了抗体的产生。促炎细胞因子相互关联（图2C）。抗病毒细胞因子IFNα和IFNγ相互关联，而IFNα与TGFβ1负相关（图 2C）。因此，三种免疫类型的特征可以由不同的细胞因子网络驱动。 2. COVID-19免疫类型可预测临床严重程度进展 作者接下来研究了这些不同的免疫类型是否与临床参数相关。如前所述，临床严重程度没有用作无监督层次聚类的变量。在研究开始时，BRI和LAI在WHO临床严重程度评分方面没有差异，而EXI显着更高（图 3A）。因此，在研究开始时，免疫类型不是由疾病严重程度决定的。为了评估住院期间的临床严重程度进展，作者检查了患者在入院后30天内表现出的最高/最差临床评分。住院期间，EXI和LAI的特征是临床恶化和更高的WHO临床严重程度峰值评分（图 3A）。相比之下，进入后BRI有所改善，临床评分下降（图 3A）。反映住院期间更严重的疾病评分，所有死亡率都发生在EXI和LAI患者中，而没有患者在BRI中死亡（图 1A、B和3B）。此外，BRI免疫型患者与EXI或LAI免疫型组患者的住院总天数（图 3C）和ICU总天数（图 3D）也存在显着差异。这些免疫类型之间严重程度的差异不能归因于年龄，因为这些差异没有显着差异（图3E）。尽管BRI和EXI组之间的性别分布显着不同（图 3F），但BRI和LAI以及EXI和LAI之间没有检测到显着差异，表明性别不是三种免疫类型的预测决定因素。为了评估和强调不同分子标记和其他变量的重要性，使用Wilcoxon秩和/Mann-Whitney U检验在三种免疫类型中直接比较这些变量。作者还使用单变量和多变量方法对每个生物标志物应用逻辑回归模型，其中性别、年龄和DFSO作为多因素生信分析的附加变量。总体而言，未检测到非参数和参数测试之间的显着差异，并进一步证实性别、年龄和DFSO没有定义免疫型的参数。因此，尽管免疫型在研究开始时疾病相对较轻，但EXI和LAI表型捕获了住院后临床恶化、死亡率更高、住院时间更长和ICU天数增加的患者，而BRI确定了临床上会改善的患者。  图3 免疫类型可预测急性 COVID-19 的临床改善或恶化 3. COVID-19免疫类型不是由疾病持续时间定义的 尽管三种免疫型在进入时从症状出现的天数（DFSO）上有所不同，但LAI的疾病持续时间最短，但DFSO的差异并不能解释这些表型（图 4A-C）。细胞因子和抗体水平与 DFSO 没有显着相关性，表明免疫类型不是由疾病持续时间决定的（图 4B，C）。更重要的是，即使在10天的DFSO仍然具有高水平的IFNα而抗体反应保持沉默后，LAI的三种免疫类型之间的抗体和细胞因子的动力学也不同（图 4B，C）。另一方面，在DFSO为5天的EXI患者中，IL-6和TNFα的含量很高（图 4B）。对于个体免疫类型，抗SARS-CoV-2抗体反应在DFSO方面具有不同的轨迹。在BRI和EXI患者中，抗体提早出现并持续存在（图 4C）。与LAI相比，BRI和EXI中抗SARS-CoV-2抗体阳性患者的频率增加，与症状出现后的时间无关（图 4D）。因此，感染持续时间不能解释LAI的高IFNα或低抗体。DFSO也未能与住院天数和ICU天数相关。这支持了这样一种观点，即免疫类型反映了个体患者的反应性质和免疫发展速度，而不是与感染持续时间的严格线性时间关系。  图4 病程不决定免疫类型 4. 免疫类型的临床实验室特征不同 三种免疫类型在血浆炎症标志物和血细胞数量方面存在显着差异。EXI中炎症C反应蛋白（CRP）、铁蛋白、d-二聚体、乳酸脱氢酶（LDH）标志物的血浆水平均显着升高（图5A）。引人注目的是，与BRI相比，LAI中的这些并没有增加。EXI 中白细胞和中性粒细胞最高，而EXI和LAI中淋巴细胞水平趋于降低，但不显着（图 5B）。然而，LAI患者的血小板显着降低（图 5B）。鼻咽拭子中的病毒载量在免疫类型之间没有显着差异，但在 LAI 中趋于更高（图 5C），而在LAI患者中，病毒载量与IFNα水平无关（图 5D）。最后，作者发现病毒载量与DFSO 之间没有相关性。  图5 免疫类型的临床实验室特征不同 5. 免疫型的深度表型揭示了COVID-19患者血液中明显的细胞变化 为了深入了解所描述的三种免疫类型背后的潜在机制，作者使用了40色光谱流式细胞术并确定了与这些免疫类型相关的免疫细胞亚群变化（图 6）。尽管非肿瘤COVID-19患者作为一个整体与健康个体明显不同，但在研究开始时比较免疫类型发现它们之间的差异非常小。与健康个体相比，非肿瘤COVID-19患者的浆母细胞增加（图 6B-D）。促炎中间单核细胞1和210以及IgD-CD27-B 细胞在患者的血液中均增加（图 6C）。相比之下，患者血液中的非经典单核细胞减少（图 6C），这些抗炎细胞的丢失可能进一步促进免疫激活。浆细胞样树突状细胞（DC）和常规DC在患者中也都减少了（图6B-D）。当将三种免疫型相互比较时，几乎没有差异（图6E，F）。与LAI相比，EXI中只有中间单核细胞2强烈增加（图 6F，G）。总体而言，尽管非肿瘤COVID-19 患者和健康对照之间存在很大差异，但免疫类型之间的差异是微妙的，这突出了免疫类型中外周血细胞和全身血浆细胞因子之间的脱节。  图6 高维流式细胞术揭示了免疫类型之间明显的免疫亚群差异 小结 作者的研究通过机器学习提出了免疫型，这些免疫型摆脱了临床分类应该主导生信分析的假设，并且可以作为前瞻性研究的基础。从临床角度来看，重要的是要在早期阶段确定哪些患者可能在疾病严重程度上进展，因为非肿瘤COVID-19患者的临床状况可能在几天内迅速恶化。在这里，作者已经确定了免疫型，这些免疫型可以预测疾病进展，但也揭示了潜在的途径，并在严重的COVID-19发展之前提出了生物标志物和治疗靶点。作者目前的研究只针对非肿瘤急性COVID-19背景下的免疫型，但它也指向采用更大规模的队列研究，这些研究可能揭示预测非肿瘤COVID-19后长期并发症的免疫型。由于免疫型鉴定只需要血清分析，因此这些免疫型可以在患者入院后快速确定，并有助于指导个性化治疗。 |
|
|
