发表期刊：Horticulture Research（IF=6.793）
发表时间：2022
合作单位：浙江省农业科学院
样本类型：梨
本研究以梨果皮赤褐色性状的12个群体的1129个F1遗传分离群体为材料，通过简化基因组构建了梨果皮的赤褐色基因图谱。利用SSR标记和SNP标记将果皮赤褐色性状精细定位在梨8号染色体末端，通过候选基因筛选结合功能验证，获得了控制梨果皮赤褐色性状基因/果实周皮发育开关基因PyPPCD1（LOC103949685）。采用RNA-seq分析评估了PyPPCD1.1的致死功能，并通过蛋白相互作用和功能分析，揭示了PyPPCD1.1-guidedPCD的作用机制。
1、触发梨果皮赤褐色的开关基因的精准定位和筛选
与绿色梨果实在整个发育过程中都被表皮膜包裹相比，赤褐色梨果实的周皮膜在表皮和木栓形成过程中涉及不断的亚细胞化和细胞死亡（图1）。采用简化基因组遗传图谱对梨果皮赤褐色性状基因进行精细定位，结果发现共有1,770个SNP位点在连锁群8上富集，在染色体末端有分布峰值。选取富集区的25个SNPs和32个多态简单重复序列（SSRs）进行F1群体的基因连锁分析。图1 14 days after anthesis（DAA）（a、d）、30 DAA（b、e）和80 DAA（c、f）时梨赤褐色与绿色果皮周皮发育的分化
russet基因位于共分离的SSR标记Zaasp792附近，近端标记物在两侧0.2和0.9 cM内（图2）。将Zaasp1147和Zaasp1213的引物序列与参考基因组进行比对，发现有48个基因在梨果实的果皮中可检测到表达。除17个在赤褐色和绿色果皮样本中均有低表达的基因外，其余基因在两个样本中均有较高的转录水平。
图2 梨果皮赤褐色性状控制基因的精细定位
a，在连锁群8上定位赤褐色位点的区域。b，基因组组装序列中唯一候选基因NW_008988105.1。c，候选基因的同源注释。
2、LOC103949685在梨组织中的表达
RNA-seq结果显示，与其他梨组织相比，果实皮中LOC103949685的表达量更高（图3a），在开花后（DAA）30天达到峰值，然后随着果实发育而下降（图3b）。此外，赤褐色果皮中等位基因A的表达与绿色果皮中等位基因D相似（图3c）。基因克隆和序列比对结果显示，与等位基因B和等位基因C相比，等位基因A和等位基因D的启动子区域都丢失了一个包含预测启动子的片段（图3d和e）。图3 LOC103949685的启动子及表达特征
a和b，LOC103949685的相对表达水平在不同的组织和发育阶段差异。c，果皮样本中亲本等位基因的表达差异。d，采用通用启动子引物对LOC103949685等位基因进行PCR产物的电泳，并以各亲本的基因组DNA为模板。e，启动子序列比对示意图。
3、证实LOC103949685等位基因A的PCD功能
由于PCD参与了梨赤褐色果皮的形成，因此，首先利用其在本氏烟草叶片中的瞬时表达分析了等位基因A的潜在功能。与预期的一样，该等位基因在叶片注射部位周围引发了严重的损伤和死亡（图4a），并在梨绿色果实皮的感染部位产生了坏死斑点（图4e）。等位基因A的致死功能解释了在赤褐色果皮中观察到的PCD，因为PCD可以产生复杂调控和周皮亚化的初始信号。图4 PyPPCD1.1在植物中的致死作用
a-c，Pyppcd1.1在本氏烟草中的表达，对照用黑色箭头表示。d和e，Pyppcd1.1（D）和PyPPCD1.1（E）和Pyppcd1.1（左）在梨绿色果皮中的表达。f，向20日龄拟南芥喷洒20μM雌二醇后，在雌二醇诱导启动子控制下，PyPPCD1.1（右）和PyPPCD1.1在拟南芥中的表达。
4、PyPPCD1.1同源物的功能保守性分析
根据NCBI公共数据库，从40个植物中查到了61个独特的PyPPCD1.1同源物。为了分析PyPPCD1.1同源物对蛋白功能的影响，从拟南芥和毛果杨中选择两个基因在本氏烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明，毛果杨PyPPCD1.1基因在N端有较高变异，但在C端保守；这一特征触发了本氏烟草叶片的PCD。而拟南芥的PyPPCD1.1同源蛋白两端变异较大，但在本氏烟草叶片中未能触发PCD（图5a和b）。
图5 本氏烟草叶片PyPPCD1.1同源表达的表型（a-c）和PyPPCD1.1与ARF1-RNAi在本氏烟草植物叶中共同表达（d，e）
5、PyPPCD1.1和Pyppcd1.1之间的亚细胞定位变化
绿色荧光蛋白（GFP）融合的亚细胞定位分析显示，Pyppcd1.1分布在细胞核、质膜、细胞骨架和细胞质中（图6a）。相反，PyPPCD1.1-GFP融合蛋白的荧光信号在细胞核和细胞骨架中较弱（图6b）；随着膜系统塌陷并且细胞死亡期间发生核碎裂，这种表达沿着质膜扩散（图6c和d）。PyPPCD1.1在感染后期促进质膜上囊泡的产生增加（图6c）。图6 PyPPCD1.1和Pyppcd1.1的亚细胞定位
6、鉴定PyPPCD1.1与ADP核糖基化因子1之间的相互作用
使用Pyppcd1.1开放阅读框（ORF）筛选梨果皮cDNA酵母双杂交（Y2H）文库。结果确定了Pyppcd1.1与ADP-核糖基化因子PyARF1之间的强相互作用；相反，PyPPCD1.1与PyARF1之间的相互作用较弱（图7a）。PyARF1的转录本和蛋白质在每种果皮中均表现出高表达水平，并且赤褐色果皮中的 ARF蛋白水平显着高于绿色果皮。
图7 PyPPCD1.1/Pyppcd1.1与PyARF1的相互作用和亚细胞共定位分析
a，通过Y2H法分析PyPPCD1.1与PyARF1之间的相互作用以及Pyppcd1.1与PyARF1之间的相互作用。b，PyPPCD1.1与ARF1之间的相互作用，以及Pyppcd1.1与PyARF1之间的相互作用的拉下实验。c，注射PyPPCD1.1和PyARF1到本氏烟草叶片72小时后的亚细胞共定位分析。
7、PyPPCD1.1以依赖ARF1的方式触发PCD
为了研究ARF1是否参与了PyPPCD1.1触发PCD，作者将PyPPCD1.1与ARF1RNAi载体共转化。结果表明，PyPPCD1.1注入本氏烟草叶片后不能启动PCD（图5d）。这一发现表明，ARF1对PyPPCD1.1-guided细胞的死亡至关重要。本研究确定了控制梨果皮赤褐色性状的基因——PyPPCD1.1，并为该性状的发育提供了新的分子调控机制。PyPPCD1作为周皮发育的控制基因，在植物耐逆境遗传改良、林木育种及梨、苹果等水果品质遗传改良中都具有潜在的应用价值。
参考文献
An ARF1-binding factor triggering programmed cell death and periderm development in pear russet fruit skin. Horticulture Research, 2022.
DOI:0.1093/hr/uhab061
