临床样本类型:1)对临床组织的直接蛋白质组学研究越来越普遍,保存组织样本的方法一般有新鲜冷冻(FF),福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和最佳切割温度嵌入等。从蛋白质组覆盖率的角度来看,FF是首选的保存方法,但FFPE组织已经储存了几十年,为临床蛋白质组学提供了广泛的临床随访和宝贵的资源。组织样本可以通过激光捕获显微切割(LCM)进一步制备,以增加空间分辨率元素。2)非侵入性或微创方式(即液体活检)获得的临床样本是研究新生物标志物的理想样本。最常被分析的生物体液是血液(血浆、血清)和尿液,其他体液包括前列腺分泌物、唾液、眼泪、脑脊液(CSF)和腹水等。
临床样本制备:蛋白质组学样本制备尚无统一的方案,但应根据蛋白质组的复杂程度、样品的可利用量和研究目标对所选择的策略进行优化/选择。MS样品制备的第一步包括从临床样品中分离和提取蛋白质。这包括提取试剂,如不同的有机溶剂和洗涤剂,然后是组织破坏技术,如冻融循环、超声或机械破坏,以最大限度地提高蛋白质提取和溶解。最近开发了不同的蛋白质纯化技术,如FASP, MStern,S‑trap,SP3,iST等,减少了蛋白质消化时间要求,并将样品损失降至最低,提升整体操作效率。
质谱配置及扫描模型:ESI依赖于成熟的反相纳米LC技术或与毛细管电泳相结合,对基于发现的实验更为实用。正交肽分离技术在临床蛋白质组学研究中的应用越来越广泛。为了提高蛋白质组的覆盖率,可以通过碱性反相液相色谱或强阳离子交换色谱分离肽池。
大多数基于发现的临床蛋白质组学研究仍然使用基于数据依赖采集模式(DDA)识别潜在的生物标志物或获得生物学见解,目前临床蛋白质组学领域正在向数据非依赖采集(DIA)转变。
蛋白定量策略:一般来说,相对定量策略用于基于发现的临床蛋白质组学。相对定量通常依赖于稳定同位素标记的使用,从而产生共价衍生肽,如SILAC,比较新的策略有TMT和iTRAQ。目标蛋白被鉴定出来后就需要进一步验证,虽然基于抗体的技术(如ELISA)履行了这一职责,但基于MS的靶向检测非常适合于验证,尤其是在没有合适的抗体可用的情况下,最常用的方法是多重反应监测(MRM)质谱,新技术有平行反应监测(PRM)质谱。