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随着人类基因组计划的完成，生命科学研究逐渐走向后基因组时代。近年来，生命科学的研究开始趋于功能基因组学。其中包括了结构基因组研究和蛋白质组学研究等内容。 蛋白质组学（Proteomics）是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成以及变化规律的科学。 经过二十余年的发展，蛋白质组学已成为精准医学研究的核心内容之一，目前广泛应用于多种癌症的临床研究领域，为药物靶点发现、癌症分型、早期诊断、个性化用药和预后判断等提供更精确、可靠的信息。 “事实上，基于人体中蛋白质成分及结构的复杂性，蛋白质的规模化分离和检测可说是限制蛋白质组学研究进程的两大难点。后者依赖于高分辨质谱分析仪器的发展，而前者往往需要科学家针对于不同类型、不同疾病的样本进行高效的样本前处理和分离。” 南方科技大学化学系教授田瑞军向生辉介绍道。
▲图 | 南方科技大学化学系教授田瑞军（来源：受访者提供） 田瑞军博士是南方科技大学化学系终身教授，国家杰出青年基金获得者。其同时兼任中国蛋白质组组织 CNHUPO 副理事长、中国化学会色谱专业委员会理事、全国色谱会学术委员会常务委员、中国质谱学会理事和中国分子系统生物学学会理事，科技部 “国家重点研发计划” 蛋白质机器专项子课题负责人、色谱杂志青年编委和国际期刊 Current Opinion in Chemical Biology Guest Editor 等多个职位。 基于其在化学、生物学和医学等多学科领域中的不断探索，多年以来，田瑞军不仅致力于蛋白质组学方法学研究的推进，同时也在细胞信号转导和肿瘤微环境等生物医学方向开展应用转化工作。迄今已在国际主流学术期刊上发表论文近百篇。 “对于蛋白质组学技术而言，最重要的其实是多维度技术的整合，这就需要来自交叉学科领域技术人才的参与和融入。” 田瑞军表示，“特别考虑到作用机制，蛋白质组学是能够以基因组学为基础继续发展的互补性技术。为了全面了解人类健康和疾病，蛋白质组学数据应该更多地从功能维度进行挖掘，也应该与其他组学的研究成果，如代谢组学、基因组学和转录组学全面结合。”
蛋白质组学分析策略能否走向产业化道路？ 蛋白质组学最早于 1994 年由 Marc Wilkins 率先提出，其本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白之间相互作用等，由此在蛋白质水平上获得对于疾病发生、细胞代谢等过程的整体性认知。 2000 年初，借助相关检测技术的迅猛发展，蛋白质组学进入了高速发展阶段。到了 2008 年，田瑞军毕业于中国科学院大连化学物理研究所并获分析化学博士学位。 其时，国际上分析检测技术、相关研究成果初现，田瑞军敏锐地注意到蛋白质组学的广阔前景。“解析蛋白质的翻译后修饰及其间的相互作用可以更好地发挥蛋白质组学的独特技术优势，有助于深入理解生命活动过程、疾病发生机理等多种医学难题，特别是对于推动大型疾病的研究具有巨大潜力。” 例如在癌症生物学领域中，对于肿瘤微环境（TME）的了解即有利于建立疾病相关机制和内部生物过程的认知。因此，田瑞军先后师从于渥太华系统生物学研究所教授 Daniel Figeys，以及加拿大西奈山医院 Lunenfeld-Tanenbaum 研究所领导者、多国院士 Tony Pawson 进行博士后研究工作，长期专注于功能蛋白组学分析技术开发及其在生物医学领域的应用。值得一提的是，Tony Pawson 院士于 90 年代末共同创立的 MDS Proteomics 公司是国际上最早推动蛋白质组学技术在新药研发中应用的范例。 2014 年，已在国外学习多年的田瑞军产生了回国发展的念头。“中国的蛋白质组学领域的学术研究在 CNHUPO 的带领下一直保持与国际同步发展的态势，但缺乏来自工业界引领性的创新技术作为推动力，导致临床研究、产业化进程十分缓慢。” 机缘巧合之下，田瑞军接受了来自南方科技大学的任职邀请，成为了这所崭新学府的 “元老” 之一。为了促进本土蛋白质组学研究的进一步发展，田瑞军从无到有搭建了南科大高分辨质谱设备平台，同时继续其针对于肿瘤领域的蛋白组学研究工作。 2019 年 4 月，田瑞军与美国多院院士、Salk 研究所的 Tony Hunter 教授于 Nature 杂志合作发表了题为 Targeting LIF-mediated paracrine interaction for pancreatic cancer therapy and monitoring 的文章，介绍了一种关键信号蛋白的作用，助力胰腺癌的精准治疗。
▲图丨2019 年第 7754 期 Nature 期刊点评及相关论文（来源：Nature） 作为恶性程度最高的肿瘤之一，胰腺癌患者的五年内生存率仅为 5% 左右。并且由于胰腺癌肿瘤细胞被重重包裹在富含胰腺星状细胞（PSC）的间质细胞层中，后者对于多种类癌症治疗药物具有抗性，因此胰腺癌的诊断和治疗均十分困难。 此前，尽管星状细胞与癌细胞间相互作用的重要性已被证实，但是介导这一胞间通讯的分泌蛋白尚未被发现。 “这种分泌蛋白负责细胞间通讯，并与胰腺癌的进展密切相关。” 田瑞军介绍道，该研究中，研究团队系统性地集成了磷酸化蛋白质组学、分泌蛋白质组学和蛋白相互作用组学策略，对源于星状细胞的分泌蛋白及其作用于癌细胞引起的胞内信号转导通路变化进行了系统性解析，进而成功地发现了来源于星状细胞的分泌配体蛋白 LIF 和其位于癌细胞表面的受体膜蛋白 LIFR 和 GP130。 研究表明，LIF 蛋白在胰腺肿瘤组织中的表达量与病人的病理状况，特别是分化状态及生存期紧密相关，并且病人血液中的 LIF 变化水平与药理反应的病理分析结果高度一致，由此证明了其作为胰腺癌生物标志物的可行性。 基于 LIF 蛋白的关键作用，加拿大的抗体开发商 NorthernBiologics 此前已将 LIF 单抗推进至 I 期临床试验阶段。在此之后，阿斯利康从该公司将其收购，并于去年将 LIF 单抗 AZD0171（MSC-1）联合 PD-L1 单抗和化疗的胰腺癌一线疗法推进至 II 期临床阶段。 在此之前，通过定量检测目标蛋白质等方式，蛋白组学广泛应用于生物医药机制研究领域。而 LIF 蛋白的研究进展则让更多人意识到，蛋白组学技术已经打开了创新药物研究领域的大门。据了解，田瑞军团队正在开发从微量临床组织样本出发的下一代临床功能蛋白质组学技术，并将其系统地应用到胰腺癌创新药物靶点及生物标志物的发现和功能研究中。
（来源：受访者提供）
集成化前处理技术，表征胰腺细胞糖蛋白仅需 1 μg 样本 在蛋白质组学研究中，蛋白质的分离和鉴定一直研究难点和目标。可以说，蛋白质组学的发展依赖于仪器设备、实验方法和计算搜索算法的进步。 “此前二十年间，新兴的高通量、高灵敏度的分离与鉴定仪器，特别是液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）设备的发展极大促进了蛋白组学的相关研究。” 顾名思义，质谱设备的检测结果即为质量谱图。在质谱中，各种待测化合物由于不同的分子质量从而具备差异化的质荷比（m/z），因此在通过电场时能够被逐一区分开来。 质谱技术最早是物理学家为测量同位素以及丰度而发明，经过一百多年的发展，现阶段的质谱技术以高特异性、高灵敏度、高准确性和单次分析的快速性而著称。 田瑞军介绍道，当前主流的蛋白质组学技术是基于自下而上（bottom-up）的方法来研究复杂样本中的蛋白质，样本类型包括血清、尿液和细胞裂解液等。 该方法于 1997 年由美国 Scripps 研究所的 John R. Yates III研究组首次提出，按照酶切、液相色谱法（LC）分离、串联质谱法（MS/MS）鉴定肽段的流程实现蛋白质的鉴定。继而通过数据库检索的方式即可同时鉴定成百上千种蛋白质，实现大规模、高通量的整体分析。 然而，基于质谱检测原理的固有缺陷也难以忽视。其首要问题即为，仅凭质谱检测难以区分同分异构体、同质异形体。由于该技术实质上是以不同质荷比作为筛选原则，而质荷比在质谱检测过程中又与分子质量息息相关，那么对于分子质量完全相同的同分异构体和同质异形体来说，其分子筛选系统自然毫无作用，需要通过与液相色谱（LC）联用或人工处理的方式实现分离。 另一方面，质谱检测设备必须辅以严格、复杂的样本前处理流程。细胞中的蛋白质需要经过一系列冗杂的前处理流程之后被提取并 “切断” 成多肽，而传输进入质谱的样本也力求纯净、无杂质、高浓度并可被离子化。对于微量且成分复杂的临床样本来说，这些要求无疑是不小的挑战。 针对这些问题，田瑞军带领其团队长期致力于探究易于操作、纯化及富集效果更优的样本前处理技术。2016 年，他首次提出了基于独特的离心移液枪头 “Spintip” 的集成式蛋白质组学前处理技术（SISPROT）并获得专利。 2022 年，基于此前的研究成果，田瑞军进一步开发了完全集成的样品制备技术 Intact GlycoSISPROT，用于对位点特异性糖肽进行高灵敏度分析。相关论文 A fully integratedsample preparation strategy for highly sensitive intact glycoproteomics 同时发表于 Analyst 期刊。
（来源：Analyst） Intact GlycoSISPROT 是一种用于对低微克甚至纳克蛋白质样品进行位点特异性糖基化分析的工具，其优势在于将完整的糖蛋白样本制备步骤集成到单个离心移液枪头中，包括蛋白质样本的预富集、还原、烷基化、酶解、反相除盐和糖肽富集过程。
▲图丨 Intact GlycoSISPROT 工作流程示意图（来源：Analyst） 该技术中，通过多步骤的有效整合得以省略冻干和样品转移步骤，减少样本损失。并且其专有的移液枪尖端引入了纳米孔材料以提高富集效果，将所需样本量从毫克级减少至微克级。该全部流程仅依靠离心机和移液枪，即可在 3 小时内完成并上机检测，有效提升了人工操作效率。 在此之后，研究人员对于 Intact GlycoSISPROT 的灵敏度和重现性也进行了系统优化和评估，并通过比较实验的方式表征 1 μg 样本中的胰腺细胞糖蛋白。 结果表明，使用 Intact GlycoSISPROT 技术共鉴定 181 个完整糖肽，包含 175 个位点特异性糖型，对应于 59 个糖基化位点以及来自 48 个糖蛋白的 54 个聚糖组合物。 而使用传统方法仅鉴定出 87 个完整的糖肽，包括对应于 31 个糖基化位点的 87 个位点特异性糖型和来自 28 个糖蛋白的 36 个聚糖组合物。 “样品前处理操作过于复杂是当前蛋白质组学领域面临的限制之一，” 田瑞军认为，过去几十年间生物质谱平台的迅猛发展，蛋白质组学的鉴定能力逐渐趋于饱和。然而，研发人员仍被淹没在蛋白质组学冗长的工作流程中。 任何一项涉及质谱仪器的实验，都需要严格执行复杂的样品前处理流程，其中耗费的时间成本不言而喻。除此之外，有限的样本数量以及高昂的实验经费也为蛋白质组学的发展制造困境。 “当前的蛋白质组学仍有多项关键性挑战需要克服，而这些挑战主要是由临床的应用需求所提出。” 田瑞军表示，在未来一段时间之内，更快、更灵敏的蛋白质组学分离和鉴定技术仍是研究者以及市场中的迫切需求。 尽管困难重重，但田瑞军对于国内的蛋白质组学技术发展十分看好。近年来，国内科学家的研究进展陆续登上国际顶刊，为该领域发展奠定了基础。同时，研究机构也逐步开始与产业界展开合作。 据悉，依托于国际原创性的高通量全自动微量样品预处理技术 SISPROT，田瑞军正在进行相关蛋白质组学项目转化，未来集中在临床功能蛋白质组，为肿瘤等重大疾病提供创新标志物和创新药物等解决方案。 “当前主要的合作方向在于生物医学领域，包括制药、检测在内其实是有很大的转化空间。在我看来，任何一项技术最后都要被推向临床、服务于临床，才能够打通走向产业化的道路。”
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