原位杂交(ISH)是一种使细胞或组织中特定DNA或RNA分子可视化的分子技术。ISH是基于DNA/DNA或DNA/RNA双链的互补性,将标记的核酸探针原位杂交到目标上。通过这种方式,我们可以获得有用的空间信息。
FISH是检测微生物、诊断实体瘤和血液瘤以及指导癌症治疗的有效临床工具。例如,FISH通常用于检测慢性髓系白血病中的BCR-ABL1 t(9;22)易位和各种癌症中的许多融合基因。FISH还被用于确认乳腺癌中HER2基因的扩增,从而确定最有可能受益于曲妥珠单抗(一种抗HER2的单克隆抗体)治疗的患者。另一个重要的例子是在非小细胞肺癌中检测EML4-ALK融合基因。随着越来越多的免疫疗法被开发和批准,研究人员试图用FISH来预测癌症免疫治疗的反应性。为了扩大FISH的有效性,可以将FISH与IHC或IF结合起来,同时检测不同细胞类型的RNA和蛋白质,以更好地表征肿瘤微环境(TME)。
为了解决传统FISH的局限性,研究人员从研究DNA转移到研究单分子RNA,并采用高通量的方法,由此产生了smFISH技术,其能够可视化和量化单个mRNA分子,并表征内源性基因表达的空间模式。通过靶向细胞mRNA而不是DNA分子,smFISH已经成为评估肿瘤内转录异质性的有力工具。
RNAscope是一种商业化的基于ISH的技术,可以检测多达12个不同的RNA靶点,并且可以方便地与IHC和/或IF结合,以自动化的方式同时研究RNA和蛋白质。相对于其他基于FISH的技术,RNAscope已经设计了13000个以上的RNA探针,并通过商业化的流程进行验证。因此,它是一种用于基础研究和临床实验的省时和友好的方法。RNAscope已经广泛应用于各个学科,包括传染病、癌症、免疫治疗、炎症和神经科学。特别是,它是IHC的一种强有力的替代方法,可以评估各种实体瘤中免疫检查点的表达,如PD-L1。通过检测特定RNA,RNAscope阐明了TME、免疫逃逸机制以及新的预测和预后癌症生物标志物。
在免疫疗法的背景下,RNAscope在理解CAR-T细胞疗法方面发挥了宝贵的作用。RNAscope已被用于评估靶基因表达的特异性,并跟踪CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的分布。扩展到人类样本,已有研究验证了BCMA的表达是多发性骨髓瘤CAR-T细胞免疫治疗的靶点。
尽管可以从RNAscope等技术中获得更高的灵敏度和特异性,但最终需要基于FISH的技术,允许进行高通量转录组分析,以更好地表征显示独特基因表达谱的稀有细胞群和细胞类型。MERFISH和seqFISH,不仅提供了改进的RNA定量、信号放大和检测,而且提供了基于图像的转录组分析。
MERFISH从smFISH改良而来,采用了基于条形码的组合标记方法,然后进行多轮杂交,以确保荧光信号的高亮度和一次可检测到的大量RNA。
seqFISH是另一种基于连续几轮条形码杂交标记的Multiplexed smFISH技术。例如,seqFISH被用来对小鼠胚胎干细胞和脑组织中>10000种mRNA进行成像,具有较高的准确性和分辨率。相关研究已证明seqFISH是研究和获得T细胞成熟过程中调控基因表达动态的有力工具。另一项研究将微流体技术与Multiplexed smFISH技术结合起来研究乳腺癌中的肿瘤异质性证明,Multiplexed smFISH可以从不同角度进一步优化。
尽管smFISH技术前景广阔,但由于探针设计、验证、图像分析和解码的复杂性,基于smFISH的复合技术尚未广泛应用于转化研究或临床应用。使用非多重FISH、定量PCR、IHC和IF在mRNA或蛋白质水平上研究单个基因的表达通常更为方便,尤其是当研究的基因数量较少时,如一组预后标志物。另一个限制是,由于序列杂交的性质,总成像时间加起来至少为18小时,还不包括最初的36~48h的探针杂交时间,因此与其他技术相比(如DSP和Visium),总体通量较低。此外,Multiplexed smFISH技术只能评估新鲜冷冻组织中一种类型的分析物,如RNA。新兴的技术如DSP,可以评估新鲜冷冻组织和病理学常规使用的标准福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中的蛋白质和RNA。