前情提要
9月18日，我们将在《RNAscope优势所在—RNAscope在肿瘤免疫微环境中的用武之地（一）》一文中，就RNAscope在肿瘤免疫微环境中的优势进行了详细的分析。本期将继续肿瘤免疫微环境的主题，说一说该方法在非小细胞肺癌和卵巢癌中针对肿瘤与肿瘤微环境的研究实例。
全篇皆干货
且读且珍惜
肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）是肿瘤细胞存在的周边环境，包括肿瘤周围的血管，免疫细胞，成纤维细胞，骨髓来源的炎症细胞，淋巴细胞，信号分子和细胞外基质（ECM）。肿瘤细胞可以通过释放细胞外信号影响周边的微环境，促进肿瘤血管增生和抑制周边的免疫细胞，而肿瘤微环境中的免疫细胞及因子又可以影响肿瘤细胞的生长（见下图）。
肿瘤微环境示意图
传统的肿瘤治疗方法例如化疗法和放疗法都将肿瘤作为一个整体，通过使用化合物或者放射物对其进行杀伤。近年来，以免疫治疗为首的新兴肿瘤治疗方法则是深入肿瘤组织内部对其进行剖析，研究肿瘤细胞与其周边微环境间的相互作用，了解为什么肿瘤细胞作为非正常细胞能够逃脱机体的免疫监控迅速大量生长，探究肿瘤微环境中的各种细胞成分的分布与变化对肿瘤细胞的作用，及其潜在治疗开发前景。
有趣的是，随着研究的深入，人们发现肿瘤细胞表面表达的免疫监测点相关蛋白的高低，肿瘤细胞周边以及肿瘤基质中哪类免疫细胞浸润分布（例如杀伤性T细胞或是抑制性T细胞，血液来源淋巴细胞或是骨髓来源单核细胞），肿瘤周边分布浸润细胞分泌的细胞因子类型（例如IFNγ, TNFα等）都与肿瘤的生长，抑制或药物治疗存在着紧密关系。也就是说肿瘤内部各分子细胞的空间分布信息在免疫治疗等他新兴肿瘤治疗方法（例如靶向治疗）中必不可少。这些发现使得对于肿瘤的原位检测变得至关重要。
为了揭示这些肿瘤内部的空间信息，针对蛋白原位检测的免疫组化方法和针对RNA水平的RNAscope技术成为两大可选方法。RNAscope公众号平台将连续三周（9月18日、9月25日以及10月9日）分别就
1）RNAscope原位检测方法在肿瘤微环境中的检测优势；
2）非小细胞肺癌和卵巢癌中针对肿瘤与肿瘤微环境的研究实例；
3）该类方法在免疫治疗药物研发和肿瘤微环境科研领域中的应用；
进行分析，探讨RNAscope方法在肿瘤微环境研究中的应用前景。敬请关注！
本篇就ACD公司R&D团队使用RNAscope原位检测技术在非小细胞肺癌以及卵巢癌中的应用实例及结果进行分析，阐述RNAscope在肿瘤以及肿瘤微环境研究中的独特优势。
一、RNAscope方法研究人非小细胞肺癌微环境中，肿瘤及免疫细胞免疫监测点的相互关系及其临床应用价值
为了了解非小细胞肺癌（NSCLC）中肿瘤细胞以及肿瘤微环境间的相互作用，ACD公司R&D团队的科研人员在两个 NSCLC TMA上的56例非小细胞肺癌样本和4例肿瘤周边样本中既检测了PD-L1这一广泛被关注的程序性死亡因子配体1的转录情况，同时共定位了PD1, PD-L2, LAG3, CTLA4, TIM3, B7H4, 4-1BB这七个免疫监测点的RNA转录情况；在非小细胞肺癌中描绘了肿瘤细胞与周边免疫细胞的分布情况（见下示意图）。
该实验分别使用了RNAscope 2.5 HD Assay-Red试剂盒以及RNAscope 2.5 HD duplex assay试剂盒对NSCLC进行了系统的检测以及数据分析。单染（RNAscope 2.5 HD Assay-Red）检测结果显示82%的NSCLC中有PD-L1的mRNA转录（RNAscope评分>=1），RNAscope评分>=2的NSCLC阳性病人样本占总检测癌症样本数的56%。下图为从56个非小细胞肺癌样本中摘取的不同PD-L1转录水平的结果。其中Core 2E2样本具有高水平的PD-L1转录（RNAscope评分为4），Core 2G3样本的PD-L1转录评分为2，Core 1F1样本的转录水平为1，而Core 1F2样本无PD-L1转录。Core 2B1为肿瘤周边组织，无PD-L1转录。DapB为阴性对照探针，对应于人的样本检测结果为0。
RNAscope评分法：
在得到了PD-L1转录结果的基础上，ACD公司R&D团队的科研人员接着使用双染的方法在非小细胞肺癌（NSCLC）TMA连续切片中，共定位PD-L1+另一种免疫监测点（PD1, PDL2, LAG3, CTLA4, TIM3, B7H4, 4-1BB），并进行评分。以观察肿瘤细胞与周边免疫细胞的相互关系。结果显示PD-L1高转录样本中（RNAscope评分>2）伴随较高转录水平的其他免疫监测点基因有CTLA4和TIM3。而在PD-L1中度转录水平的样本中（RNAscope评分=2），PD1，PD-L2，LAG3，CTLA4，TIM3，B7H4，4-1BB均在肿瘤微环境中的免疫细胞内有中度水平的转录。下图分别列举了两个tissue core的例子，Core 2E2显示PD-L1高转录（绿色，RNAscope评分=4）伴随TME中高水平的其他免疫监测点基因转录。而Core 1B3无PD-L1转录，伴随TME中其他免疫监测点不同水平的基因转录。
以下是在肿瘤内，使用RNAscope 2.5 HD duplex assay共定位两个免疫监测点的图像聚焦放大结果。在PD-L1与PD-1共定位的检测中，如下图所示，PD-L1（绿色信号点）转录主要集中在肿瘤细胞内，而PD-1（红色信号点）分布在淋巴细胞中，这些淋巴细胞除了在肿瘤基质（stromal）区域分布，同时也有细胞浸润到肿瘤区域（下图）。
在PD-L1与PD-L2共定位的检测中，PD-L1（绿色信号点）同样主要在肿瘤细胞内转录，同时有较多的 PD-L2（红色信号点）与PD-L1共定位肿瘤细胞的分布（下图，黑色箭头所示）：
在PD-L1与CTLA4共定位的检测中，PD-L1在肿瘤细胞内转录，而CTLA4（红色信号点）在基质细胞和淋巴细胞内存在转录（下图）：
在PD-L1与LAG3共定位的检测中，PD-L1主要在肿瘤细胞中转录，而LAG3（红色信号点）在淋巴细胞中转录，主要集中在基质区域（下图）。
在PD-L1与TIM3共定位的检测中，PD-L1主要在肿瘤细胞中转录，而TIM3（红色信号点）在淋巴细胞中转录，主要集中在基质区域（下图），有少数TIM3转录阳性淋巴细胞浸润到肿瘤区域。少数细胞中发现有PD-L1与TIM3在同一细胞中发生转录。
值得注意的是即使在PD-L1高转录的NSCLC中，其肿瘤微环境中的免疫监测点所在细胞的分布也是有差异的。如下图所示，Core 1B1和2E2均为PD-L1（绿色信号点）高转录的非小细胞肺癌，在1B1中的LAG3（红色信号点）转录分布在基质细胞和浸润到肿瘤内的细胞中，而在2E2中则主要集中在基质内；TIM3在1B1中主要在淋巴细胞中转录且局限在基质细胞内，而在2E2中TIM3转录阳性淋巴细胞浸润到肿瘤内且存在于PD-L1共同转录的细胞内；PD-L2在1B1中只局限在基质中，而在2E2中则在肿瘤区域也有转录，且部分细胞内有PD-L2与PD-L1共定位。这一差异提示这两类病人在接受相关免疫治疗时肿瘤将存在不同的药物反应。
在定性分析（RNAscope评分）的基础上，NSCLC的数据被进一步通过绝对定量的方法进行了深入的分析。通过使用 HALO软件可以对整个芯片全部组织进行绝对定量分析。下图为对Core 1B1中PD-L1和 LAG3的分布情况进行HALO数据分析后得到的LAG3转录阳性细胞在肿瘤区域，基质区域以及整个组织块中的百分比；PD-L1的相应数据也在同一张柱形图中展示。
RNAscope对TME中免疫监测点共定位的优势在于可以在组织上观察到每个肿瘤内部目标基因转录的独特分布趋势。如下图所示， 虽然1B1和2E2这两例样本中均有较高水平的PD-L1和PD-L2的表达，但是在1B1中两者分别在不同的细胞中发生转录；而在2E2中，有很多细胞内同时具有这两个免疫检测点配体基因的共转录（红圈）。这一结果是无法通过非原位检测技术观测到的。
在近期发表的针对肿瘤进行抗PD1药物治疗的研究中，人们发现免疫T细胞会在治疗过程中上调细胞表面的TIM3从而产生继发性耐药。下图中左侧的RNAscope结果提示了非小细胞肺癌样本中出现了大量PD1与TIM3共转录淋巴细胞的分布，提示对该类病人进行PD1治疗时，可通过TIM3抑制剂对抗耐药现象。
除了双靶点RNA可见光检测外，当存在在同一切片内对多个靶标进行分析的需求时，RNAscope multiplex assay可以满足在同一切片内进行三到四个靶点RNA的检测。也可以结合免疫组化与RNAscope方法，在一张切片中使用荧光同时定位多个靶点的mRNA与蛋白质。下图为使用RNAscope技术在人的非小细胞肺癌中内检测IDO的mRNA（免疫监测点），PD-L1的mRNA（程序性死亡因子配体）和CD8蛋白（杀伤性T细胞）的分布。结果显示在肿瘤细胞内有PD-L1的mRNA转录（红色），在其周围有CD8阳性（白色）杀伤性T细胞的浸润，同时浸润的一些淋巴细胞内也存在IDO（绿色）mRNA的转录。
二、RNAscope方法研究人卵巢癌微环境中，肿瘤细胞与免疫细胞及细胞因子/趋化因子的相互关系，以及其临床应用价值
与非小细胞肺癌的研究类似，ACD公司的科研人员在人卵巢癌的样本中通过RNAscope的方法定位肿瘤微环境中血液来源和骨髓来源的免疫细胞的分布，以及这些细胞分泌表达的细胞因子/趋化因子的分布情况，用以评估肿瘤微环境中免疫细胞及因子对于肿瘤细胞的作用以及潜在的治疗前景。
下图为使用RNAscope 2.5 HD assay-Red的方法检测人卵巢癌中转录表达CD45（基因名PCPRC），CD68，FOXP3，IFNγ（基因名IFNG），CXCL13和TGFβ（基因名TGFB1）细胞的定位分布情况。众所周知，CD45主要在造血前体细胞中表达，参与调节T细胞和B细胞的活性；CD68在单核细胞和巨噬细胞中表达，用以标记骨髓来源巨噬细胞的分布；FOXP3在调节性T细胞（Treg）中转录表达，Treg在肿瘤中的存在抑制了杀伤性T细胞活性，降低免疫细胞对于肿瘤细胞的杀伤。IFNγ属于二型干扰素，主要由NK和NKT细胞分泌，它是诱导M1型巨噬细胞（杀伤性）的主要细胞因子；CXCL13在TFH细胞中表达，并诱导B细胞活性；TGFβ由多种细胞分泌，负向调控包括T细胞，B细胞和巨噬细胞在内的杀伤作用。下图显示了不同来源的免疫细胞以及参与免疫调节的细胞因子在同一卵巢癌连续切片中的分布情况。
通过RNAscope 2.5 HD duplex assay结合使用两种免疫细胞标记物或免疫细胞标记物加细胞因子，可以定位某种免疫细胞及其相关诱导因子的分布情况。例如在下图中，CD8+IFNγ提示卵巢癌中淋巴来源的T杀伤细胞与诱导巨噬细胞的IFNγ的分布关系，CD68+CXCL10检测巨噬细胞以及巨噬细胞趋化因子的定位；CD4+FOXP3则提示肿瘤内CD4阳性T细胞以及调节性T细胞的分布；CD163+CCL22提示肿瘤内M2型巨噬细胞及其分泌因子的定位情况。从而帮助研究者确定肿瘤微环境中不同类型免疫细胞（骨髓来源与血液淋巴组织来源）的分布，及其对周边炎症细胞的影响（分泌的细胞因子）。
在另一项独立研究中，ACD公司的R&D团队在人的宫颈癌样本中使用RNAscope® Fluorescent Multiplex Assay 结合免疫组化的方法，在同一张切片内检测到肿瘤细胞内表达Ki67蛋白（红色），与此同时在肿瘤周边有CD4 mRNA转录阳性T细胞（绿色），CD8 mRNA阳性T细胞（黄色）以及CD68 mRNA转录阳性巨噬细胞的浸润。提示了这一肿瘤周边免疫细胞的分布情况。
未完
