师说新语︱专访夏永振教授：工程改造益生菌治疗高尿酸血症

今日嘉宾

夏永振

山东大学微生物技术国家重点实验室教授，博导

专家简介 

夏永振，博士，山东大学微生物技术国家重点实验室教授，博士生导师，齐鲁青年学者。所在团队是环境微生物与合成生物学实验室。主要研究领域为细菌硫代谢和合成生物学技术创新。2006年于山东大学获得生物技术学士学位；2012年于山东大学获得博士学位；2009年到2011年在德国明斯特大学进行公派联合培养博士研究；2012年博士毕业后留校任教，工作至今。曾在以ISME J, Nucleic Acids Research，Gut Microbes等为代表的主流专业期刊上发表署名通讯作者/第一作者的SCI论文共18篇。

随着我国经济的发展，人民的生活水平得到了很大程度的改善，高嘌呤饮食消费明显增加。伴随着饮食习惯的改变，高尿酸血症的患病率明显提升，这一病症已成为继高血压、高血糖、高血脂之后中国“第四高”。其主要诱因是由于富含嘌呤的食物在人体内不完全降解为尿酸，在组织中的积累所致。长期尿酸过高，将引发痛风、糖尿病、肾损伤、高血压等疾病，对人体健康带来重大影响。

截止2021年，高尿酸血症的患病率已经达到13.3%，已经成为继糖尿病之后第二普遍的代谢性疾病。此外，高尿酸血症患者不断增多且呈现年轻化趋势，很多年轻人纷纷中招，体内尿酸过高导致的痛风已经成为“当代青年的新痛点”。

本次工程微生物学公众号邀请到夏永振教授，与读者一起分享他最新关于工程化改造益生菌治疗痛风的研究成果和一些思考。

能否介绍一下您是怎么想到用细菌治疗高尿酸血症的构思？

本研究的顺利开展既有一些偶然性，也有一些必然因素。契机是实验室相继出现了两位痛风病人，这让我们对痛风和高尿酸血症以及人体嘌呤代谢的关系有了一些感性认识；现在身边的很多同事朋友，包括我博士期间都是做合成生物学研究。长期的接触和了解，使得自己也掌握了一些合成生物学的研究策略和操作手段。这为后期实验的推进提供了技术保障。

从这两位患者的求诊中，了解到目前可用于临床的药物仍然具有局限性。非布司他、苯溴马隆等常用药物都有着很大的副作用，一般用于治疗慢性期痛风，并不建议用于急性期痛风的治疗。而治疗急性痛风主要疗法是止痛，基本是通过食疗，即降低嘌呤摄取来治疗的。但这会给患者的饮食带来很大的挑战，是一个比较痛苦的过程。

通过查阅文献，我们了解到体内多余的尿酸通过肾脏和肠道排出，其中1/3尿酸的排出通过肠道完成，并能够被肠道菌群进一步代谢。这些早前的研究激发了我们的设想：或许可以借助合成生物学的改造，增强肠道益生菌的尿酸降解能力，再将其引入到肠道中，从而发挥缓解高尿酸血症的疗效。

血尿酸的1/3通过肠道排泄，并且会被肠道菌所降解

为什么选择大肠杆菌Nissle 1917，它相对于其它益生菌有哪些优势？

大肠杆菌Nissle 1917 (EcN)是一株公认的益生菌，在一个世纪前就已被用于治疗炎症性肠病和肠易激综合征。此外，与其他的益生菌相比较，EcN菌株的分子遗传学特征研究的比较清楚。近几年，随着合成生物学的不断发展，开发可作为治疗药物的工程益生菌已成为当下的研究热点。由于EcN本身的安全特性和遗传可塑性，它也常被用做载体构建的工程菌，被用来治疗多种疾病。近几年的研究中，以EcN作为宿主菌株，构建了治疗苯丙酮尿症、高氨血症、肠胃炎以及结直肠癌等疾病的工程菌株，都取得了良好的效果。前人的经验为我们的研究提供了很大的帮助。

同时，EcN菌株还被注射到血液中用于肿瘤的治疗。在近几年的研究中，通过静脉注射，EcN能够作为向肿瘤部位递送抗癌药物的载体，这也证明将一定量的EcN注射到血液中也是相对安全的。这也为我们在实验中选择注射EcN用于高尿酸血症的治疗提供了启示。

在大肠杆菌中表达这条尿酸氧化途径的最大挑战是什么？

这条异源途径的构建主要有三部分难点：第一部分是现有的尿酸降解途径需要氧气，而肠道是一个厌氧的环境。但通过查阅文献，我们发现肠道中的氧气存在着不均一性：离小肠绒毛越近的地方，氧气含量相对充足；接近肠中腔的位置则趋向无氧环境。这些较新的认识使我们意识到，肠道中存在可以使用的氧气，但比较有限。为了进一步增强细菌中氧气的供应，我们通过过表达细菌血红蛋白vhb基因，提高了细菌的携氧水平；同时还过表达了大肠杆菌自身编码的过氧化氢酶KatG。H₂O₂是尿酸降解的副产物，KatG可以将H₂O₂降解为O₂，O₂又可以被回收利用，用于进一步降解尿酸。这两种酶的引入成功实现了O₂的回收利用。

第二部分，异源表达时，我们尝试了不同的质粒骨架以及启动子，发现过高拷贝的质粒以及强启动子表达对菌株的代谢负担加重，严重影响菌株的生长；使用低拷贝质粒时，菌株的尿酸降解速率无法达到预期。在此我们尝试了很多方案，也走了很多弯路，所幸最后我们找到了我们认为最优表达体系。

第三部分，我们参照文献报道对UOX酶活进行了定向进化，发现突变后虽然粗酶液酶活的V_max有所提升，但是K_m相比不突变时也增大了，这使得重组菌株在尿酸低浓度条件下的降解能力受到了影响。为了解决这一问题，我们引入了尿酸转运蛋白YgfU，成功解决了这一问题。

将重组菌用于小鼠模型治疗的时候存在哪些挑战？

在使用重组菌进行小鼠高尿酸血症体内治疗时也遇到了较多困难。一个客观难题是我们团队缺少鼠房，很幸运的是我们通过跟肠道微生物与菌群互作学术团队的王明钰老师合作解决了这一难题。在真正操作时，却发现小鼠体内尿酸浓度偏低，尿酸酶在低浓度尿酸下酶活偏低；还发现传统建模常用试剂氧嗪酸钾会进一步抑制工程菌中尿酸氧化酶的活性。这些研究结果表明传统的小鼠建模方法并不适用于测定工程细菌的功能。因此，我们采用静脉注射尿酸的方法快速提升小鼠血液中尿酸的浓度，建立了构建小鼠急性高尿酸血症模型的新方法。该方法可以在短期内模拟人体尿酸的浓度，但只能维持1小时左右，这表明这种方法仍需要进一步优化。但值得一提的是，在这1小时的窗口期，我们构建的工程菌显著降低了小鼠体内的血尿酸浓度，这个结果可以证明我们的方法适用于验证工程菌的疗效。

工程菌的构建、小鼠的急性高尿酸血症建模与治疗方案

您在工作中特别注重研究工具的开发和优化，能否谈谈这方面的心得？

目前工程益生菌的研究非常火热，除了EcN菌株外，很多肠道益生菌也都被改造用于疾病的治疗。比如将双歧杆菌Bifidobacterium longum进行改造治疗癌症，将乳酸菌Lactobacillus reuteri、Lactococcus lactis以及Lactobacillus gasseri进行改造治疗肠胃炎、糖尿病等等。美国的ZBiotics公司甚至推出了一款工程化枯草芽孢杆菌用于分解小肠中的乙醇，缓解宿醉。

截止目前，治疗高尿酸血症和痛风的工程菌的相关研究较少，但是兰州大学的李祥锴教授团队从浆水中分离的乳酸菌Limosilactobacillus fermentum JL-3以及日本的研究团队分离出的乳酸菌Lactobacillus. gasseri PA-3都证实对高尿酸血症有一定的治疗效果，推测这些菌株具有较强的嘌呤和核酸代谢能力，这些菌株可以降低人体对嘌呤等物质的吸收，进而缓解高尿酸血症。后续的机制研究可能会揭开其具体的机理。

您在工作中注重研究工具的开发和优化，能否谈谈这方面的心得？

我对研究工具的开发主要集中在实验室的一些常用技术上，包括克隆、转化与点突变技术等。我觉得这些技术是完成基本的克隆操作所必须的，也是实验室最常用的技术手段。DNA组装试剂盒与感受态细胞已经成为很多实验室的常用消耗品。于是便产生了一个问题，如果这些材料全部采用商业化试剂，价格会比较昂贵，个人配制的话，效率往往又不及商业化的水平。

基于此，为了解决这一矛盾，我们计划去建立一种低成本并且可以媲美商业化水平效率的DNA克隆和点突变系统。经过长期的努力，我们成功建立了一种超低成本的DNA组装技术TEDA，又建立了一种简便可行的超高化学感受态细胞制备方法，还修订并优化出一种简便的DNA点突变方法。我们将这些技术组合在一起，成功的将DNA克隆的效率去媲美最好的商业化水平，而所需要的物料成本基本上可以忽略不计。这些技术通过本课题组的多次实践，表明它们能够很好得提高克隆的成功率，降低了实验室的花费，还减少了基本实验操作所消耗的时间和精力。

近年来工程生物学的研究亮点频出，给社会公众带来了很多惊喜和期待。您觉得该项研究成果的产业化前景如何？

我们很期待可以继续推进这项研究成果的后续研究，乃至产业化应用，但我们认为还有一段路要走。

本人是个产业化的门外汉，但也确实就推进产业化进行了一些思考，在这里谈一下自己的浅薄认识，欢迎大家的批评指正。

1、我们的研究表明，小鼠并不是一个很好的研究高尿酸血症的宿主模型（虽然很多文献都在用）。我们觉得如果要进一步尝试其可行性，需要通过更高等的动物进行尝试。但这种研究条件并不是普通实验室所具备的，需要花时间和精力寻找有兴趣的合作对象。

2、我们现在是通过质粒和传统的IPTG诱导的方式来表达这些重组酶，但在真正应用前，应该尝试解决质粒稳定性与诱导剂的问题。我们正在考虑将重组基因簇插入基因组来使其更加稳定，采用氧气诱导等方式使得其可以在肠道中稳定的自发进行。

科研成果实用化是近年来国家大政所指，这也是我一直以来的理想和愿景。但作为一名科研工作者，一个人的力量有限，对真正的产业化过程理解的也尚浅薄。希望能够有机会结交更多的有识之士，对我们这个项目给予一些评估和指导。这些来自市场角度的评估可能会方便我们调整研究方向，让我们真正朝着产业化应用的目标而努力。

您能否跟年轻学子们分享一下您的心路历程？

谈心路不太敢当，自己只是众多普通青年学者中的一员，学术经历尚浅。如果拿孙悟空学筋斗云相比，我这最多还在爬云而已。简单聊聊几点心得，抛砖引玉吧，不对的地方，仅供消遣。

能取得这些许进步，要特别感谢我本硕博就读的山东大学和博士联培的德国明斯特大学对我的培养。求学路上遇到了诸多贵人，他们给了我很多帮助。本科期间，班级学习氛围浓厚，我被带动着掌握了一些专业知识，也学会了一定的自学方法，不过当时真没想到这些会成为我从事科研工作的基础，现在想来也是窃喜。硕博连读早期阶段受到了良好的微生物与代谢工程的基础操作和实验设计的培训，期间做了很多有趣的科研尝试，尽管最终没有成功，但让我掌握了更多处理研究中“负结果”的心态和方法，这也成为了我科研生涯的一笔宝贵财富。在德国明斯特大学的博士后经历也非常宝贵，不仅增长了我的国际视野，也让我真正学会应该如何独立思考并去解决具体的科学问题。

留校任教进入了环境微生物与合成生物学团队，在这里我也一直在成长。从一开始PI提出科学问题自己设计实验去验证，逐渐过渡到自己能产生新想法后去指导学生。在不断坚持的文献阅读中，在组内外老师学生的不断讨论中，视野在开阔，思维在拓展，凝练问题的能力也在增强。这种点滴的进步让我很高兴，反过来更加深了我对科研的兴趣。

总体上，要不断审视并培养适合自己做科研的方法和心态。面对研究中不断出现的问题，要调整心态积极去应对，并积累一些适合自己的方法去寻找问题的解决方案，去开拓新思路。积极观察和学习身边的榜样也是一种很好的方式，这可以使我们更快地取得进步。这样不断增强的心态和累积的能力又会成为发展我们科研兴趣的不竭源泉。

环境微生物与合成生物学团队的活动

关于本刊

Engineering Microbiology以提高微生物的产业应用价值为导向，发表微生物领域高水平、创新型研究成果。期刊接收包括原创研究论文、综述、短通讯、研究热点等多种类型的文章，提供专业、快速的同行评审服务，打造世界一流的高水平、国际化微生物领域学术期刊。