【原】开发用红光控制生命现象的技术~实现基因表达和DNA重组反应的光操作~研究成果

开发用红光控制生命现象的技术~实现基因表达和DNA重组反应的光操作~研究成果

刊登日期: 2022年6月14日 东京大学 神奈川县立产业技术综合研究所 理化研究所 东京都立大学 科技振兴机构( JST ) 主讲人 桑崎勇人(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业研究生(研究当时) ) 山本翔太(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业特别研究员(研究当时) ) 小田部尧广(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业特聘研究员(研究当时) ) 中嶋隆浩(神奈川县立产业技术综合研究所全职研究员) 清水义宏(理化研究所生命功能科学研究中心无细胞蛋白质合成研究小组组长) 成川礼(东京都立大学研究生院理学研究科生命科学专业副教授) 矢泽真幸(哥伦比亚大学康复再生医疗学科药理学科副教授) 佐藤守俊(东京大学研究生院综合文化研究科广域科学专业教授)

发布要点 开发可以用红光控制生命现象的基础技术。 具体实现红光基因表达和DNA重组反应的光操作。 期待着生物深部生物分子和基因向功能阐明的展开

发布概述 东京大学研究生院综合文化研究科的桑崎勇人研究生(研究当时)和佐藤守俊教授是该研究科的山本翔太研究员(研究当时)、小田部尧广研究员(研究当时)、神奈川县立产业技术综合研究所的中嶋隆浩研究员、以及理化学研究所生命功能科学研究中心的清水义宏团队组长、 通过与东京都立大学研究生院理学研究科的成川礼副教授、哥伦比亚大学康复再生医疗学科药理学科的矢泽真幸副教授等的共同研究，成功开发出了可以用生物组织透过性极高的红光操作生物深部生命现象的光开关蛋白质( magred:magred )。 光开关蛋白是用光操作细胞内和生物体内各种生物分子功能的基础技术工具。 虽然已经报道了几种基于红光的光开关蛋白质，但还存在哺乳类所没有的需要添加色素的点、光控制能力明显低的点、没有通用性的点等重大课题。 本研究开发的MagRed不需要添加外源性色素，仅红色光的onoff就具有极高的控制能力，同时凭借其通用性，实现了基因表达和DNA重组反应的光操作。 这种新型红光开关蛋白有望极大地拓展生命现象光操作的应用潜力。 本研究成果刊登在英国科学杂志《Nature Biotechnology》(在线版: 6月13日(英国夏令时间) )上。 本研究成果是， 国立研究开发法人科学技术振兴机构( JST )的战略性创造研究推进事业( CREST )“利用光的特性开发和应用生命功能的时空控制技术”(研究总结:影山龙一郎理化学研究所脑神经科学研究中心中心中心长)中的“基因组的光操作技术的开发和在生命现象阐明中的应用”( JST ) 课题编号: JPMJCR1653 )、神奈川县立产业技术综合研究所( KISTEC )的战略性研究系列培养事业(研究代表:佐藤守俊)、日本学术振兴会作为utec-u Tokyo FSI research grant program (研究代表:佐藤守俊)、日本学术振兴会( JSPS )特别研究员DC2 (研究代表:桑崎勇人，课题编号: JP20J14492 )的一部分获得。

发布详细信息 研究背景

近年来，在生命现象和疾病中发挥重要作用的基因和生物分子可以用光自由操作的技术备受关注。 特别是，相当于被称为“生物体之窗(注1 )”的波长区域( 650~800 nm )的红光难以被生物体组织吸收，容易到达生物体深部，因此期待开发基于红光的光操作技术。 虽然已经报道了一些现有技术，但都存在着由于没有通用性和普遍性，与光照射无关地工作，所以光控制能力明显低的课题，以及需要添加哺乳类所没有的来自光合生物的色素等不便。 在这样的背景下，迫切需要开发能够克服现有技术问题的基于红色光的光操作基础技术。

研究内容 本研究组在各种细菌所携带的红光受体蛋白的细菌细胞色素( BphP ) (注2 )中，特别关注放射抗性细菌( Deinococcus radiodurans )所具有的BphP(DrBphP ) DrBphP以哺乳动物细胞内在色素的胆绿素( BV，注3 )为辅因子结合，具有结构响应红光(~ 660 nm )发生较大变化的性质。 通过开发识别并结合该DrBphP结构变化的蛋白质(以下称为粘合剂)，认为可以开发红色光开关蛋白质(图1 )。 制作了抗体样分子仿射体(注4 )的突变体库，使用核糖体显示法(注5 )，分离了仅在照射红光的条件下与DrBphP结合的仿射体作为候选粘合剂。 通过对用该进化分子工程学方法(注6 )得到的候选粘合剂进行氨基酸变异和末端氨基酸的删除等修饰，成功开发了改善了红光照射时的结合效率的粘合剂。 这种由DrBphP和仿射体(粘合剂)组成的光开关蛋白，意为本研究小组以前开发的蓝色光开关蛋白“Magnet”(磁铁，注7 )的红色版本，称为“MagRed”(灰色)（図1）。

图1 .本研究开发的红光开关蛋白“MagRed”(岩浆)。 ( a ) MagRed由辐射抗性细菌( Deinococcus radiodurans )携带的红光受体( DrBphP )及其结合蛋白(纤维体)组成。 DrBphP(Pr型，暗状态)吸收红光(~ 660 nm )后结构变化成为Pfr型(亮状态)，与仿射体结合。 在此，通过照射800 nm的光或在暗环境下放置，DrBphP恢复到原来的结构( Pr型、暗状态)，仿射体解离。 ( b )抗体样分子仿射体的结构。 构成α螺旋表面的13个氨基酸是可变的，通过改变它们可以开发抗原特异性纤维体。 本研究利用进化分子工程学的方法等，开发了与吸收红光(~ 660 nm )的DrBphP特异性结合的仿射体。 然后研究了MagRed在基因表达光操作技术( CPTS ) (注8 )中的应用(图2 )。 CPTS是本研究小组以前利用蓝光开关蛋白和CRISPR-Cas9系统(注9 )报道的基因表达的光操作技术。 将其他研究组报道的两个红光开关蛋白( RpBphP1-PpsR2、RpBphP1-QPAS1)应用于CPTS，尽管均在暗环境下，但检测到较高的基因表达活性(图3 )。 由此可见，现有红光开关蛋白的光调控能力明显较低。 另一方面，使用MagRed的CPTS(Red-CPTS )在暗环境下几乎检测不到活性，通过红色光照射可以高效地诱导基因表达，由此可知MagRed具有极高的光控制能力(图3 )。 另外，通过使用Red-CPTS，通过红色光照射，基因组中编码的多个内源基因也成功地同时激活了(通过红色光照射，内源基因的表达最多激活378倍)。

图2 .用2.MagRed开发的红光基因表达的光操作技术“Red-CPTS”。 为了操作基因组上目标基因的表达，使用加入变异而失去DNA切断活性的Cas9(dCas9 )。 作为使dCas9与DNA结合的向导RNA，使用插入了MS2 RNA适体的向导RNA。 MS2蛋白与转录激活结构域( p65-HSF1 )连接MagRed。 红光照射下，MagRed结合，dCas9结合的基因区域被激发转录激活结构域，因此可以针对该基因的表达进行激活。

图3 .与现有红光开关蛋白的比较。 ( a )生物发光报告显示，采用MagRed的Red-CPTS在暗环境下几乎不具有基因表达活性，响应红光照射强度表现出较高的基因表达活性。 用现有红光开关蛋白( b:RpBphP1-PpsR2，c:RpBphP1-QPAS1)代替( b，c ) MagRed构建基因表达的光操作技术，均在暗环境下表现出较高的基因表达活性，对红光的响应性明显较低。( d )用各自暗环境下的响应将a、b、c在红光照射时的响应标准化。 可见，MagRed的光调控能力明显高于现有红光开关蛋白。 此外，还研究了使用MagRed的红光重组DNA反应在光操作技术中的应用。 催化DNA重组反应的Cre重组酶(注10 )作为从基因组中敲除(删除)目标基因碱基序列的酶，在世界各地的研究室中被广泛使用。 因此，通过将Cre重组酶分割为2个进行失活，并在该分割体( split-Cre )上连接MagRed，开发出在暗环境下不具有DNA重组活性、在红光照射下出现高活性的DNA重组酶( RedPA-Cre ) 将用红光控制的4种现有技术与此次开发的RedPA-Cre进行比较，发现RedPA-Cre可以更高效地对DNA重组反应进行光操作(比较红光和暗环境下的响应比例，RedPA-Cre是现有技术哦) 此外，研究表明，将RedPA-Cre和上述Red-CPTS分别导入小鼠肝脏，通过生物体外无创照射红光，均可在该器官中高效操作基因的作用(图5、图6 )。

图4 .用4.MagRed开发的红光重组DNA反应的光操作技术“RedPA-Cre”。 开发了一种酶( RedPA-Cre )，通过将MagRed连接到将Cre重组酶分割为两部分失活制备的split-Cre上，通过红色缔合，出现DNA重组活性。 红光激活的RedPA-Cre可以从基因组中删除被称为loxP的34个碱基序列夹持的碱基序列(基因等)。 利用这种DNA重组反应，可以用红光瞄准基因敲除基因，也可以激活基因。

图5 .应用5.RedPA-Cre在小鼠机体深部(肝脏)光操作DNA重组反应。 ( a ) LED从小鼠体外无创照射红光的情况。 ( b )肝脏导入RedPA-Cre和生物发光报告(与活化的RedPA-Cre反应产生生物发光的报告)的小鼠，通过生物体外的红光照射，观察到了肝脏发出的生物发光信号。 这表明，即使是体外光照，在小鼠机体深部，RedPA-Cre也能高效诱导DNA重组反应。 图中的“p”表示p值。 “N.S .”表示无显著性差异。

图6 .利用6.Red-CPTS在小鼠机体深部(肝脏)光操作基因表达。 ( a )肝脏导入Red-CPTS和生物发光报告( GAL4UAS :与活化的Red-CPTS反应产生生物发光的报告)的小鼠在暗环境下不显示生物发光信号，但活体外无创照射红光可在该小鼠肝脏观察到生物发光信号。( b )将( a )的实验中得到的图像数据表示为数值数据，并进行了统计处理。 同时给出了用空载体( Empty )代替生物发光报告器( GAL4UAS )的控制实验结果。 暗环境下生物发光信号与调控实验生物发光信号无显著差异，表明Red-CPTS在暗环境下几乎没有活性，小鼠机体(体外)也具有较高的光调控能力。 ( c )应用Red-CPTS显示小鼠肝脏基因组编码内源基因(以mASCL1为例)的表达可通过体外无创红光照射进行光操作。

如上所述，本研究小组作为红光生命现象的光操作的基础技术(平台技术)，开发了响应红光的光开关蛋白“MagRed”，并且应用了MagRed的基因表达的光操作技术“Red-CPTS” 本成果有望在生物深部生命现象的阐明、包括基因疾病和细胞治疗等生命科学医学领域在内的广泛研究领域中发挥作用。

咨询方式 <有关研究的事情> 东京大学研究生院综合文化研究科 教授佐藤守俊 邮编〒153-8902东京都目黑区驹场3-8-1 Tel:[phone] E-mail:moritoshisato (请在末尾加上“@g.ecc.”) 理化研究所生命功能科学研究中心无细胞蛋白质合成研究小组 组长清水义宏 邮编〒565-0874大阪府吹田市古江台6-2-3 Tel:[phone] E-mail:yshimizu (请在末尾加上“@riken.jp”) 东京都立大学研究生院理学研究科生命科学专业 副教授成川礼 邮编〒192-0397东京都八王子市南大泽1-1 Tel:[phone] E-mail:narikawa.rei (请在末尾加上“@tmu.ac.jp”) <关于JST事业的事> 科技振兴机构战略研究推进部创新组 保田睦子 Tel:[phone] E-mail:crest (请在末尾加上“@jst.go.jp”) <关于KISTEC事业的事> 神奈川县立产业技术综合研究所 研发部区域创新推广科区域创新推广组 泷元宏治 邮编〒213-0012神奈川县川崎市高津区坂户3-2-1 Tel:[phone] E-mail:rep-kenkyu (请在末尾加上“@kistec.jp”) <有关报道的事情> 东京大学教养学部等总务科宣传信息企划小组 Tel:[phone] E-mail:koho-jyoho.c (请在末尾加上“@gs.mail.”) 理化研究所宣传室新闻负责人 电子邮件: ex-press (请在末尾加上“@riken.jp”) 东京都公立大学法人 东京都立大学管理部企划宣传科宣传系 Tel:[phone] E-mail:info (请在末尾加上“@jmj.tmu.ac.jp”) 科学技术振兴机构宣传科 Tel:[phone] E-mail:jstkoho (请在末尾加上“@jst.go.jp”)

用语解说 (注1 )生物组织吸收光的主要物质是血红蛋白和水。 血红蛋白对短波长的光具有比650 nm更强的吸收，水对长波长的光具有比800 nm更强的吸收。 血红蛋白和水吸收弱的650~800 nm的波长区域，光对生物体组织的透过性非常高，因此被称为“生物体之窗”。 (注2 )细菌细胞色素( BphP )是储存在细菌中的细胞色素样光接受蛋白。 结合哺乳动物细胞内在色素胆绿素( BV )作为吸收光的辅助因子。 BphP具有Pr型(暗状态)和Pfr型(亮状态)两种结构，当Pr型吸收红光时变为Pfr型。 Pfr型通过照射波长比红色光更长的光，或者在暗环境下放置，返回Pr型。 Pr型和Pfr型之间的结构变化(光转换)是可逆的。 (注3 )开环四吡咯胆绿素( BV )是血红素的代谢产物，共价连接于BphP的Cys残基。 在红光照射下，BV的C15位和C16位之间的双键发生Z/E异构化时，会发生BphP的结构变化( Pr型/Pfr型)。 (注4 )亲和体是一个由58个氨基酸组成的小蛋白质，来源于金黄色葡萄球菌蛋白a的z结构域。 构成α螺旋表面的13个氨基酸是可变的，通过改变它们，可以开发出与各种蛋白质特异性结合的仿射体。 (注5 )核糖体显示法是从随机氨基酸序列的肽中筛选有用序列分子的方法之一。 利用肽-核糖体-mRNA复合物回收对靶分子亲和性高的复合物，通过逆转录PCR该mRNA只能扩增亲和性高的肽。 本研究建立了上述仿射体13个氨基酸中随机突变的突变体库，分离出了与吸收红光的DrBphP特异性结合的仿射体。 (注6 )进化分子工程学方法是指在试管中实验性地快速再现地球上进行的反复突变和淘汰(筛选)导致的生物进化周期，对分子(蛋白质等)的功能进行改良的研究方法。 通过在筛选方法上下功夫，可以选择出最适合所需功能的变异体并进行改良的“定向进化”。 (注7 ) Magnet是一对两个蛋白质( pMag和nMag )，它们是通过对阿卡帕霉( Neurospora crassa )的蓝光受体( Vivid )进行多角度蛋白工程开发而成的。 pMag和nMag在暗处等蓝色光不存在的情况下，分别作为单体存在。 一旦接受蓝光，就会相互耦合。 由本研究组开发报告( NAT.commun.6，6256 ( 2015 ).doi: 10.1038/ncomms7256 )。 (注8 ) cpts ( crispr-cas9- based photoactivatable transcription system )是一种设计为缺失切割活性的Cas9(dCas9 )、靶基因上游结合dCas9的gRNA 光照下转录激活结构域被吸引到靶基因上游，可以激活靶基因的转录。 由本研究组开发报告( NAT.methods.14，963-966 ( 2017 ).doi: 10.1038/nmeth.4430 )。 (注9 ) CRISPR-Cas9系统被发现为原核生物对噬菌体的免疫系统，目前已被用作人工切割基因组的基因组编辑技术。 被称为Cas9的DNA裂解酶与导向RNA(gRNA )一起与DNA结合，位点特异性地裂解其DNA序列。 只要正确设计导向RNA 5’末端的碱基序列( 20个碱基左右)，就具有确定基因组断裂位点的优点。 (注10 ) Cre重组酶是噬菌体中发现的酶，它能识别由34个碱基对组成的称为loxP的DNA序列并催化DNA重组反应。 通过用2个loxP序列夹持任意的DNA序列(基因等)，可以从基因组上敲除(删除)该DNA序列。 也可以通过清除转录终止序列(如poly A )或逆转靶基因来调控靶基因的表达(通断)。

论文信息Yuto Kuwasaki, Kazushi Suzuki, Gaigai Yu, Shota Yamamoto, Takahiro Otabe, Yuki Kakihara, Michiru Nishiwaki, Keita Miyake, Keiji Fushimi, Ramsey Bekdash, Yoshihiro Shimizu, Rei Narikawa, Takahiro Nakajima, Masayuki Yazawa, Moritoshi Sato*, "A red light–responsive photoswitch for deep tissue optogenetics," Nature Biotechnology: 2022年6月13日, doi:10.1038/s41587-022-01351-w.
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