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Q师弟 小花师姐，我最近看到什么DO、DIO、FLEX系统的，据说都是Cre-LoxP系统，那么他们之间有什么差异啊？ 小花师姐 师弟，要了解这三种系统的差异，我们首先必须先了解什么是Cre-LoxP系统。 Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。 Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。 LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。LoxP位点的序列如下所示：其中，“N”表示可能变化的碱基。 通过高通量筛选，我们获得了不同的LoxP序列，如下表所示： 不同LoxP位点序列表 那么当Cre与LoxP相遇时，他们之间又将发生怎样的故事，使得Cre-LoxP系统名气大振呢？主要有以下三种情景哦~ ✫ 情景一 当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（图1A）； ✫ 情景二 当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列（图1B）； ✫ 情景三 当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位（图1C）。 图1 Cre-LoxP系统基本工作原理示意图 However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，A、B、C三种场景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？ 如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态。也就可以通过Cre的存在与否来控制基因的表达了。 So，在这个基础上，也就产生了DO（Cre-off）、DIO（Cre-on）和Cre-Switch（Cre-off/on）。这三种系统中，LoxP序列在同一条载体上，并且方向相同， 只是外源基因的插入方向不同。 ➩ DO系统（Cre-off） 插入基因与启动子方向一致，在Cre重组酶存在的情况下会发生重组导致基因方向反向，因此基因不表达，所以称之为Cre-Off； ➩ DIO系统（Cre-on） 插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达，因此该系统称之为Cre-On； ➩ Cre-Switch系统（Cre-off/on） 对于Cre-Switch来讲，则是在LoxP序列之间插入了两个阅读框，而这两个阅读框的方向相反，则可以通过Cre酶的存在与否来控制这两个基因的表达。 ➩ FLEX系统（Cre-on） FLEX系统与DIO系统一致，只是LoxP位点方向与DIO系统不同。插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达。 在当今世界上，Cre-LoxP系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，主要是因为该系统具有如下优点： ◉ 高效性 Cre重组酶与具有LoxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效； ◉ 特异性强 LoxP序列的唯一性，保证基因重组的特异性； ◉ 应用范围广 Cre重组酶可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ◉ 可由二型启动子启动表达 Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的生理条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。 小花师姐 当然Cre-LoxP系统如此的受人青睐，主要是它还可以和其他技术联合应用，比如说光遗传、钙成像、药理学等等，而当Cre与他们相遇时，那将是一篇又一篇的高分paper！所以，师弟，加油吧！ 为了加快各位的科研进展，吉凯基因储备了多种不同类型的AAV-Cre病毒，包括光遗传、钙成像、药理学等，如果感兴趣，欢迎来电咨询哦~~~ |
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