绪 论中枢神经系统（脑、脑干及脊髓）固定根据需要有两种形式： 脑、脊髓组织柔软（尤其是幼小动物及胚胎）及结构细致，最好用整体固定法。将脑与脊髓从颅腔与脊柱剥出后再分开（在延髓与脊髓交界处横切）分别浸入固定液。固定脑的容器宽大（圆缸较好），成人脑应用宽大容器，用线扎住脑的基底动脉，使脑倒悬在固定器皿内，各面不与容器接触，以免受压变形。脊髓最好放在长形容器内，使脊髓伸直。如在开颅前先自左心室或颈动脉将固定液灌注（待取下由脑动脉或基底动脉灌注），再取脑浸于固定液，人，有助于固定组织均匀迅速，但在以后的技术处理是不一定能得到好的效果，原因不明（可能是灌注的固定液容积不如浸泡充分而影响处理）。整体固定，脑连同小脑和脑干常需２周，成人脑更长达1~2月，才能使脑组织变硬、固定良好。 另一种是切片法。新鲜脑组织切块取材，稍切厚些，以便切片时不受当时刀切面影响。 脑组织长期固定应隔日换新鲜固定液一次，尤其在前两天应每天换新液一次。脑侧脑室由胼胝体注射固定液，充分固定脑室附近组织。 脊髓伸直固定，可纵行剪开硬脊膜，将展开的两翼用大头针固定于长木条上。 肌肉或神经纤维，以硬卡片垫底稍将组织伸张固定。 固定液选择，首先决定于所用的方法和固定液配方。最常用10％甲醛（福尔马林）液或10%甲醛生理盐水液。 一些神经末梢和溃变纤维银染法，多由冰冻切片完成；大片的脑组织染色或镀银（如Nissl法或Golgi法）及髓鞘染色（Pal-Weigert法）等，多用火棉胶切片（常规及快速火棉胶包埋法）；一些神经末梢，习惯于用石蜡切片。 脑用石蜡包埋时，浸蜡时间稍长，否则石蜡不易浸透。 用火棉胶包埋的脑组织，除Golgi镀银法及其类似法外，一般须经充分脱水和浸胶时间；Golgi法（包括Cox法等）只需火棉胶起暂时的支持作用，长时间酒精脱水可致银（汞）沉淀分解，只要火棉胶略浸入组织，达到切片的目的（这类切片较厚，组织内部（未浸透火棉胶）也能切完整，不需长时间在酒精或火棉胶内浸泡。冰冻切片一般不需要媒介物支持包埋，如需较大切片或松软易碎组织，可经明胶包埋后再切（组织水洗后，入5%、10%或20%明胶，24h/37℃，装于组织托上，再浸10%甲醛液硬化，再冰冻切片）。除石蜡切片外，火棉胶切片、冰冻切片不需在载玻片上再染色。较方便的办法是，用直径10cm培养皿装切片，用烧扁头的玻棒或新毛笔捞取，用吸水纸沾去多余的水分或酒精（整培养皿的脱水换酒精，则用毛笔或玻棒稍挡，全盘倾倒，不使切片倒出，然后倒扣于吸水纸上）。 注意事项： 任何玻璃器皿，尤其用于银染的，应用清洁液浸洗。所有用过后的玻璃器皿，应在未干时立即洗净并浸泡于清洁液内。 配制溶液用蒸馏水。硝酸银水溶液最好用双蒸水，硝酸银水溶液应清澈透明，出现轻度混浊应弃去。 避免用含金属离子的酒精，包括无水硫酸铜脱水的无水酒精。 溶液按百分比计。如1%硝酸银指硝酸银1g溶于蒸馏水100ml。浓度超过10%，则溶剂相对减少，如40%氢氧化钠水溶液，取氢氧化钠40g，溶于蒸馏水60ml。 试剂、染料配好成水溶液，不必大量留存，且以有色瓶贮存。 夹取银染的组织块时，忌用金属镊子，如用金属镊子，应在镊子顶端粘溶蜡。捞取切片时用玻棒或新毛笔。 神经组织取材时动作轻柔，不要切取大块，酒精脱水时级差不要太大。 某些镀银或染色等要求高于室温的恒温箱内进行几天，应注意选用质量好的温箱。 准备一个小暗箱，作室温镀金、镀银用。 切片不太薄（小于10㎛），薄切片会将观察的结构切丢或侵害成不成形的碎段。 不应轻易改变技术方法的内容，除非制作后的重复性较满意，有了一定把握后，再试作改进。 多参阅别人的报导资料，汲取经验。操作时随时记录工作情况，如时间、温度、试剂浓度至水洗次数等。结果最好能拍照留底。 一般染色能显示神经组织各种非特异性结构。常用的有苏木精-伊红染色、苏木精-Van Gieson染色法、Mallory三色染色法、Mallory磷钨酸-苏木精染色法。 第一章 石蜡切片注意材料新鲜，否则会直接影响组织（尤其神经组织）切片的质量和成功率。一般在麻醉状态下取材。 取材前尽量避免动物过度疲劳，迅速将动物杀死。多用麻醉法——乙醚、氯仿或戊巴比妥钠（30mg/kg）。 动物死后，血液循环停止，细胞逐渐死亡，组织结构破坏，出现自溶和失去原来的结构。 固定液可防止组织自溶和腐败，沉淀或凝固组织内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分，使细胞结构保持与生活状态时相仿；硬化组织，增加组织硬度，使组织不易变形。 固定的组织必须新鲜。一般在动物死后立即取材。组织越新鲜越好。取脑和脊髓时，从灌注固定后取材，即在动物麻醉状态下，直接从心脏灌注固定液。 固定时间长短与组织块大小及固定液性质有关。固定液对组织硬化强，固定时间短，以免组织过硬，影响切片质量。 有些试剂能保持较长时间，对组织无大影响。 固定时注意：（1）组织块不宜过大，一般0.5cm2；（2）固定液要考虑它对组织的穿透力和对组织收缩或膨胀作用。固定液量为组织的30倍，固定时间一般为24h。 常用固定液： 甲醛：穿透力较强，对组织收缩较少，广泛用于组织固定。经甲醛（福尔马林）固定的组织，可直接入脱水剂脱水。固定时间长的组织，因含有甲酸，需流水冲洗24~48h，否则会影响染色效果。 10%福尔马林液：甲醛10ml，自来水或蒸馏水90ml 中性福尔马林液：将甲醛液放入500ml玻璃瓶，加入适量碳酸镁，中和后pH7.6.或用碳酸钙中和后pH6.3~6.5。振荡后放置24h，取上清液用。 磷酸缓冲甲醛液：甲醛10ml，蒸馏水90ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠6.5g。组织长期浸泡，不会失去染色性质，制作电镜标本对结构保持较好。 Carnoy液：无水酒精60ml，冰醋酸10ml，三氯甲烷30ml。穿透速度快，小块组织固定30min。无水酒精固定细胞质和肝糖原，冰醋酸固定染色质，增加穿透力。 固定后直接入无水酒精脱水2次。适用于组织学染色，特别是尼氏体染色。 Bouin液：苦味酸饱和水溶液75ml，甲醛25ml，冰醋酸5ml。收缩少，穿透速度快。 固定后直接入70%酒精脱色（加入几滴浓氨水）。 保持细胞微细结构，组织易染色。冰醋酸固定细胞质，苦味酸保持适当硬度。 Zenker液：重铬酸钾2.5g，氯化汞5g，蒸馏水100ml，加温溶解，冷却过滤，棕色瓶保存。用时加冰醋酸5ml。固定后对细胞核和细胞质染色清晰。固定12~24h，自来水冲洗4h。转入脱水剂。 Heidenhain Susa液：氯化汞4.5g，氯化钠0.5g，三氯醋酸2g，蒸馏水80ml。用时加冰醋酸4ml，甲醛20ml。固定12~24h，直接入95%酒精加碘洒脱汞。渗透力强，收缩小。 灌注固定法 1.固定前的准备 准备大白鼠1只，盐水吊瓶（500ml）2个，玻璃插管几个（按动物主动脉粗细而定），生理盐水（0.85~0.90%加1%亚硝酸钠），用于扩张血管。固定液。脱脂棉，丝线，止血钳，剪刀，镊子，解剖刀，骨钳等。麻醉药乙醚、戊巴比妥钠等。 2.麻醉方法： 将动物放在玻璃缸中，在缸中放入一块浸有乙醚的棉花，盖紧玻璃缸，密闭数分钟，待动物期过后，前后肢放松，即可将动物取出，准备灌注。 或配制3%戊巴比妥钠，按动物体重（30mg/kg）作静脉或腹腔注射麻醉，出现麻醉状态即可。 两种方法不要使动物深度麻醉，避免死亡影响灌注效果。 3.灌注方法： 先将已预热的生理盐水（37℃）倒入一个盐水吊瓶中。另一个盐水吊瓶倒入固定液。灌注前先将输液管内灌入生理盐水，使输液管内水流畅通，切忌管内有气泡。如有气泡，可堵在血管，灌注效果。 将已死动物仰卧在解剖台上，固定好四肢。用左手持镊子夹起腹部皮肤，右手持剪刀自腹部剪一小口，由此沿腹中线向前将皮肤剪至下颌，分离皮下组织，将皮肤翻向两侧，再沿胸骨剑突中线纵行剪开，沿膈或肋缘向两侧剪开，打开胸腔，暴露心脏，小心用镊子将心包拱形，滴一些生理盐水保持湿润。 将主动脉分离出来，穿过2根丝线，1根准备扎玻璃插管，另1根待灌注完毕时结扎血管。此时，将左心室尖剪开一小孔，迅速将连接盐水吊瓶的玻璃插管从左心室插入主动脉内，用丝线牢固地结扎在玻璃插管头上，使插管不能退出心脏，这时开放生理盐水进行灌注。待见到右心房逐渐膨胀起来，用小剪刀将右心耳剪开一小孔，使血液排出。如此冲洗至肝脏变白色为止（或舌尖等变成白色）。接着灌注固定液。固定液进入血管后逐渐出现肌肉抽动，灌注待全身器官组织变硬，结扎主动脉，拔出插管。此时可取材或将动物继续放入固定液保存。 脱水：将固定后的组织内的水分脱掉。冰冻切片不用脱水。包埋剂如石蜡、火棉胶不溶于水。用石蜡或火棉胶包埋的组织，进入包埋剂前，必须经各级酒精脱水，并放入溶石蜡或火棉胶的溶质中。溶解石蜡的试剂有苯、甲苯、二甲苯；溶解火棉胶的试剂有乙醚酒精。 透明：组织进入包埋剂前出现的透明现象。 将组织从透明剂取出，投入软蜡（熔点52~54℃石蜡），再入硬蜡（熔点56~60℃石蜡）。能熔蜡的温度也会使组织变硬变脆，故组织块不能在熔化的石蜡液停留时间过长，温度不能超过65℃。 浸蜡前注意脱水是否彻底，如果不彻底透明，重返脱水，直到透明为止。 包埋：将包埋石蜡倒入包容容器内，用镊子夹住组织块迅速投入石蜡中。拿组织块时，不能停留在空气中时间过长，以免组织块表面凝固，造成组织块与包埋石蜡不能融合。最后将盛有组织块的容器慢慢平放在冷水中。 先将蜡块修整好，焊在组织托上，组织周围和蜡不少于2mm。蜡块修成长方形或正方形，边缘笔直，戛然切出的蜡带会弯曲。 调整蜡块面与切片刀片角度（6~10°）。角度不够，刀刃不能切到组织；角度过大，将组织切碎。 旋转速度均匀。不均匀会使切片厚薄不一。切好的蜡带有序平放在盘内。准备贴片。 贴片前需要展片。
图 1 切片刀与组织块间的角度 A:倾斜度不足，根本不能切片 B:倾斜度恰当(6°)能切好切片 C:倾斜度过大，不能切片 在干净的载玻片上涂上一薄层蛋白甘油，滴一滴蒸馏水，在酒精灯上加温，将切好的蜡带轻轻放在载玻片上。此时蜡带自行舒展，如有折叠，用组织针按住折叠轻轻乐器两侧抻拉使之全部蜡带和组织摊平整。将蛋白甘油涂抹均匀，滴上蒸馏水，将已展好的组织切片移到此载玻片上，排列整齐，将多余的水倒去，放在烤箱烤干待用。 水捞法：将电热水浴箱摊片机加温至35~45℃，将蜡片光滑面向下铺于水槽中，蜡片自然伸展平整。将有蛋白甘油的载玻片伸入水中，轻轻捞起蜡片，再用组织针将草带放在合适的位置，倒去多余的水，放烤箱烘干。 展片后千万不要在室温自然晾干，否则切片会在脱蜡或脱水时容易脱落。 蛋白甘油：取新鲜鸡蛋清30ml在搅拌器中充分搅拌，直到蛋白成为水样。加等量甘油混合，过滤，放少许麝香草酚防腐，冰箱保存备用。 第二章 火棉胶切片取材、固定同石蜡切片。 经甲醛固定的标本，经自来水和蒸馏水冲洗后，进入50%、70%、80%、95%、100%酒精脱水。脱水时间依组织块大小而定。 投入乙醚酒精等量混合液24h，放入2%、4%、6%、8%、12%、15%、20%和25%火棉胶液浸透。浸胶需要较长时间。 为节省火棉胶，用下法浸胶： 组织在乙醚酒精12~24h透明，换一次新液。此时称出火棉胶20g，在25天左右内逐渐放入其中，每次放入少许。这样由稀到浓渗透彻底，待20g火棉胶全部溶解，再放入5g，完成总量25%火棉胶。 浸胶时间 视组织块大小而定。3×5×5m左右脑组织需10天左右，兔全脑2个月左右。组织块越大，浸渍时间越长，有的需3~12个月。 按下图以硬纸折成包埋盒，包埋盒大小仪组织块大小而定。
图 2 火棉胶包埋纸盒折叠法 先折1、2线，再折3、4线，使A、B两折痕重叠而折出7线。赋法折出5、6、8线。再折C、D线，即成包埋纸盒。 根据组织块大小而定。图中1、2、3、4为盒底。将纸盒叠好后，在盒内面涂一薄层凡士林，将组织块轻轻放入纸盒中，倾入足够的火棉胶，其液面盖过包埋的组织。 将包埋盒放入密封的玻璃缸中，待乙醚酒精缓慢挥发，火棉胶渐渐硬化。不宜挥发太快，否则会出现外面坚硬、内部柔软，给切面带来困难（厚薄不均）。用折叠的纸盒包埋，注意盒四壁比盒底挥发快，要将盒底和盒壁适当颠倒，使整个火棉胶块软硬一致。待内外硬度一致，将纸盒去掉，放入80%酒精保存。 需用火棉胶切片机。 将80%酒精滴在组织块和切片刀上，只能一片一片的，要连续切片，按下法操作。 ●切片前先准备一些片页纸，裁成比组织大的方形，在纸上用铅笔写上号码。在盛有80%酒精的盒碟中，先将1号纸放入其中，切下的第一张切片放在第一张纸上。以后按顺序排列，直到切完。染色时再从第一号开始。用此法适用于大块组织，操作方便。 ●切片前先准备一份砚墨和狼毫小楷笔。先将已包埋好的组织块修整，在火棉胶组织块左下方留出一个圈套的角，切片时将第一片切片后放在一张载玻片上。用胶脂棉将𨞋下角擦干，用毛笔沾上研好的墨汁将序号写在左下角处，待干（字干但不能让组织干）。干后将切片放入80%酒精，这样写出的字在酒精中褪掉，可保持到封固前。 ●切片前先准备好载玻片，在载玻片右上角处用钻石笔写上号码、动物名称、厚度，涂上少许蛋白甘油。按顺序切片。将切片按顺序在载玻片上从左向右码好，直到放满为止。用片页纸（折叠厚一些）按住切片吸干酒精，立即滴上乙醚酒精，使火棉胶溶化为一体。等乙醚酒精挥发后，载玻片进入95%酒精约5min，80%酒精5min。从80%酒精中取出，用片页纸压平。入70%酒精5min，同法压平吸干。入50%酒精5min，入蒸馏水待染。 第三章 苏木精-伊红染色⒈按常规石蜡切片法贴片，经二甲苯脱蜡后，下行至蒸馏水待染。 ⒉苏木精染色：常用的苏木精染液有Mayer苏木精、Ehrlich苏木精等。苏木精染色10~30min。Zenker液固定的组织，染色时间加长。 ⒊将组织从苏木精染液中取出，自来水洗去多余染料。 ⒋分色：将切片入含0.1~0.5%盐酸的70%酒精分色，在显微镜下检查至核呈紫红色、细胞质无色。不同组织苏木精染色和分色时间不尽相同。 ⒌将切片入自来水冲洗或加数滴浓氨水碱化至细胞核呈蓝色。 ⒍将切片入蒸馏水冲洗，去掉碱性物质，否则对伊红染色不利。 ⒎复染：切片入1%伊红水溶液染色10~30min。 ⒏水洗：将切片入蒸馏水洗去多余伊红染料。 ⒐脱水：切片依次经70%、805、95%、100%酒精。低浓度酒精稍快些，不然伊红易褪色。至95%酒精后对伊红分色，在显微镜下细胞质和结缔组织纤维呈桃红色。最后入无水酒精。 ⒑透明、封固：切片入二甲苯2次，用中性树胶封固。 染色结果：细胞核蓝至深蓝色，细胞质、胶原纤维、肌纤维及嗜酸性颗粒粉红色或浅红色，对比鲜明。 苏木精配制： ⑴Ehrlich苏木精：苏木精2g溶于无水酒精100ml，加蒸馏水、甘油及钾明矾3g，冰醋酸10ml，混合后呈浅红色。用数层纱布将瓶口绑住，敞开，经6~8周成熟，溶液呈紫红色。可长期保存。 ⑵Hansen铬矾苏木精：铬明矾10g溶于蒸馏水250ml，煮沸至溶液呈绿色。再用另一瓶热蒸馏水15ml溶解苏木精1g，溶解后倒入铬明矾液，充分摇荡混合，再加入10%硫酸5ml。再用重铬酸钾0.55g溶于蒸馏水20ml，将此液倒入上述混合液，加热煮沸1~2min，冷却后过滤使用。保存性好。染30s~5min可使细胞核呈蓝黑色，不过染也不易褪色，如硫酸量减至1~3ml，可使细胞质着色。 第四章 神经元（神经细胞）第一节 神经元胞体和突起 ⑴取材：狗、猫、兔大小脑。兔大小脑较易显示。 ⑵固定：10%中性甲醛固定7天以上（不超过1年）。流水冲洗24h，入蒸馏水洗24h（换几次）。 ⑶预染：组织块在避光情况下放入3%重铬酸钾水溶液3天以上，每天换新液。在37℃温箱进行。 ⑷用吸水纸或滤纸吸干组织块，浸入少量1.5~3%硝酸银水溶液，开始出现红棕色沉淀，换几次硝酸银后，直到不析出沉淀为止。最后将组织浸泡于硝酸银液，避光37℃浸染3天。徒手切片检查已显示细胞后，进行高尔基快速火棉胶包埋。 ⑸包埋：经95%、无水酒精、乙醚酒精各30min，浸4%、12%火棉胶各30min。 ⑹切片、脱水、透明、封片。 从火棉胶中取出组织块，置于木质火棉胶头，放入硫酸干燥器内1h左右，再在硫酸干燥器内放入氯仿5~10ml（装于小培养皿中）1h，火棉胶切片（80~100㎛）。切片时用70~80%酒精浸润组织块。 切片经95%、无水酒精，石炭酸-二甲苯（1：3），经二甲苯洗净（高浓度酒精中，火棉胶切片不可久搁，脱水主要靠石炭酸-二甲苯完成），火棉胶切片透明后，用眼科剪尽量修去组织块周围的火棉胶，置于载玻片上，用吸水纸吸干压平，用浓中性树胶封片。 结果：大脑锥体细胞、小脑梨形细胞及突起呈棕黑色。 制作大脑锥体细胞和小脑梨形细胞注意： ①组织很新鲜，玻璃器皿相当干净，重铬酸钾、硝酸银用AR试剂，染液量充分宽裕。 ②浸银后95%以上酒精不宜久搁，每次不超过30min。有时可用无水酒精95份加氯仿5份脱水。 ③忌用盖玻片。 ④将大脑髓质部分尽量修去，仅留皮质，染出的细胞较多。 ⑤以浓中性树胶封片，显微镜观察时，极易将胶表层擦坏，只要将载玻片连同切片一同浸入二甲苯片刻、晾干，即可观察。 高尔基染色法 方法： ⑴取材：人的新鲜材料难得，可用狗、猫、兔神经组织，组织块厚度5mm左右。也可钭动物灌注固定后取材。 ⑵固定：10%甲醛固定7天，自来水冲洗12~24h，蒸馏水浸泡12h。 ⑶预染：入3%重铬酸钾水溶液，瓶外用黑纸包裹，置37~40℃恒温箱3天。 ⑷镀银：先用少量1.5%硝酸銀水溶液浸洗组织块，组织块周围出现沉淀，倒出沉淀，再换新液，直到无沉淀出现。再倒入新银液，仍用黑纸包好，放入37~40℃恒温箱3天。 ⑸脱水：将组织从硝酸銀水溶液取出，直接入95%酒精30min，入100%酒精30min。 ⑹浸胶和包埋：组织从100%酒精取出，入稀火棉胶30min，取出后，再入浓火棉胶浸泡30~60min。将组织块放在木托上包埋。在放组织块的容器内倒入少量氯仿，促进火棉胶凝固。待火棉胶变硬后，将组织块浸入下列混合油液。 混合油液： 配方1：苯酚（phenol）50g，麝香草酚（thymol）50ml，香橼油（香柠檬油Bergamotoil）25ml 配方2：苯酚10~20g，二甲苯30ml 苯酚含量多少依组织块大小或空气湿度情况而定，可适当增减。 ⑺切片：切片厚度80~100μm，用毛笔将上述油液滴在切片刀面和组织块上，切下的组织仍放在此液内。 ⑻透明：切片在混合油液很快透明，由于组织切片上带有许多苯酚，要用二甲苯冲洗2~3次方可封装。 ⑼封装：用达玛（Damar）胶封装，不加盖玻片。 方法： ⑴组织块(厚度1cm以下)固定于10%中性甲醛液24h或更长。亦可直接固定于下液： 3.5%重铬酸钾水溶液30ml，甲醛10ml ⑵入3.5%重铬酸钾水溶液3~7天，每天换新液。 Hardesty各种神经组织铬化时间： 无髓神经纤维7天，小脑梨形细胞、脊髓、周围神经节细胞5天，神经胶质细胞3天 ⑶入1~1.5%硝酸銀水溶液1天（室温避光）。用吸水纸或滤纸吸干组织块，浸入少量1.5~3%硝酸银水溶液，开始出现红棕色沉淀，换几次硝酸银后，直到不析出沉淀为止。最后将组织浸泡于硝酸银液，避光37℃浸染3天。徒手切片检查已显示细胞后，蒸馏水稍洗。按Golgi法快速火棉胶包埋法包埋切片，切片80~100㎛。 ⑷浓中性树胶封片。 方法： ⑴取兔、猴、狗大小脑组织固定于10%甲醛液2天至1年。 ⑵直接入2.5%重铬酸钾水溶液34~38℃恒温箱2~3天，每天换新液。 ⑶用吸水纸或滤纸吸干。 ⑷入少量2%硝酸銀水溶液洗至无红棕色沉淀为止，浸染于2%硝酸銀水溶液1~3天（34~38℃，避光）。徒手切片检查见已显示细胞为止。 ⑸常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。 ⑹切片20㎛以上。 此法显示大脑锥体细胞和小脑梨形细胞，效果令人满意。组织块不宜太大，厚度1~2mm为宜。切片不能太薄，最低20㎛。最大优点是能制作石蜡切片，并用盖玻片封固。 Cox法 本法是Golgi法改良法，主要腫显示大脑锥体细胞和小脑梨形细胞。最大优点是用一种混合液达到固定兼染色的目的。 ⑴取新鲜组织（最好不超过5mm厚）浸入下液1个月以上，室温或37℃温箱均可。 5%重铬酸钾水溶液100ml，5%铬酸水溶液80ml，5%升汞水溶液100ml，蒸馏水200ml 配制方式有二：一是依次加入；另一种是先将重铬酸钾及升汞混合，再将蒸馏水稀释铬酸，最后并成一液。不能产生沉淀，否则无效。临用时配制。宜用AR试剂。浸染量要充足，最好在瓶底垫上胶脂棉并在避光情况下浸染。最好在组织块染24h后换一次新液。 ⑵经相当时间，徒手切片检查已达染色要求，经蒸馏水稍洗，冰冻切片70㎛以上或按Golgi快速火棉胶包埋切片。 ⑶冰冻切片可暂存蒸馏水内，火棉胶切片暂存70%酒精内. ⑷如系冰冻切片，浸入5%碳酸钠水溶液或5~10%稀氨水中。如系火棉胶切片，则浸入以70%酒精配制的5%碳酸钠溶液或5~10%稀氨水.可使颜色加深至黑色，浸潤时间以颜色适度为准，一般30min。现一般用稀氨水而很少用碳酸钠使白色升汞变成黑色。 ⑸蒸馏水洗或70%酒精洗。 ⑹按Golgi法脱水，透明，封片。或用Cox法卦片。 Cox封固剂配制：山达胶（sandarae）75g，樟脑15g，纯松节油20ml，熏衣草油22.5ml，无水酒精75ml，蓖麻油5~10滴。 封片方法：切片经95%酒精脱水后即可封固，一般不加盖玻片为佳。 Mann主张将Cox浸染液用蒸馏水稀释一倍，于37℃恒温箱内浸染24h后换新液，第三天再换一次。用凡士林封闭瓶口，防止挥发。在恒温箱浸染1月以上。 Da Fano将Mann浸染法稍作改进。经Mann法处理后的组织块，于室温浸染相同时间，结果令人满意。 孟瑞朝将组织块按Da Fano法处理后，蒸馏水洗数小时，经80%、95%、100%酒精3~4天，洗去组织块中的升汞及脱水，按普通火棉胶包埋法进行。用70%酒精硬化火棉胶块，保存于80%酒精(可停留数天至数周)。 经火棉胶切片（70~100㎛），将切片放入60%酒精，蒸馏水充分洗涤，浸入5~10%氨水，切片呈灰色或黑色，蒸馏水速洗。入5%硫代硫酸钠水溶液3~5min，蒸馏水洗，经30%、50%、70%酒精（每级酒精以酒精5ml加碘酒1滴浓度加入），每级酒精10~15min。经80%、95%酒精脱水及洗碘，经石炭酸-二甲苯、二甲苯，常规封片（可加盖玻片），制成永久标本。 第三节 轴突（轴索，正常轴突、变性轴突） Nauta和Gygax法染变性轴突和正常轴突 灌注固定法： ⑴用0.9%氯化钠液灌注洗出血液。 ⑵再用5%重铬酸钾和2.5%铬酸钾水溶液500ml灌注固定。 ⑶取出组织，固定于10%中性甲醛液7天或更长（可达3月）。 ⑷取5~10mm厚的组织流水冲洗24h，放入装有25%明胶水溶液的培养皿中（加盖），于37℃温箱浸泡12~18h，进行明胶包埋。 ⑸包埋后置于10%冷甲醛液6h或更长。 ⑹冰冻切片15~25㎛，室温下放入10%甲醛液。可在此液保存，或置冰箱保存。 试剂： ⑴氨银液：硝酸银6.9g，蒸馏水20ml，无水酒精10ml，浓氨水1.8ml，2.5%氢氧化钠水溶液1.5ml ⑵还原液：蒸馏水400ml，无水酒精45ml，10%甲醛液13.5ml，1%枸橼酸水溶液13.5ml 方法： ⑴浸切片于15%酒精30min，蒸馏水速洗。 ⑵浸入0.5%磷钼酸水溶液15~20min。 ⑶不经水洗，直接入0.5%高锰酸钾水溶液4~10min，蒸馏水洗。 ⑷入1%对苯二酚和等量1%草酸水溶液1~2min，蒸馏水洗3次。 ⑸浸于1%硝酸银水溶液20~30min。 ⑹切片一张一张地用蒸馏水洗，浸入新配制的氨银液1min。 ⑺入还原液约1min，切片呈棕色，蒸馏水速洗。如颜色太浅，可在氨银液中加少量氢氧化钠；如颜色太深，可加少量浓氨水。 ⑻入10%硫代硫酸钠水溶液固定2min，蒸馏水洗3次。 ⑼用Albrecht法封固： ①切片浸于10%明胶水溶液与等量80%酒精5min或更长。 ②切片摊于载玻片上，使载玻片略呈倾斜度倒出多余水分，并将切片周围擦干，注意勿使切片完全干燥。 ③用经95%酒精浸泡的吸水纸将切片压平。 ④迅速浸入95%酒精使明胶凝固。 ⑤脱水，透明，封片。 结果：正常轴突呈深浅不同的棕色，变性轴突黑色。 Davenport石蜡切片銀浸法 ⑴组织固定于10%甲醛液加5%冰醋酸24~36h，流水冲洗及蒸馏水洗各24h。 ⑵脱水，石蜡包埋，切片，粘片。 ⑶切片脱蜡，涂一层火棉胶，以80%酒精硬化. ⑷入下液室温浸12h，暗处。 硝酸銀10g，蒸馏水10ml，95%酒精100ml，1N硝酸10~14滴。 ⑸95%酒精洗短时。 ⑹入下液还原： 焦性没食子酸5g，95%酒精100ml，中性甲醛5ml 仅用一次。还原时镜检，有髓神经纤维轴突先着色，无髓神经纤维轴突后着色。 ⑺95%酒精冲洗，乙醚酒精将火棉胶膜溶去。 ⑻95%及无水酒精脱水，透明，封片。 结果：轴突黑色，背景黄色。 Mihalik利用Davenport法浸染胎儿组织，取得良好效果，但须改良。 固定早期胚胎，如神经胚用不加冰醋酸的甲醛，仍能保存神经原纤维的微细结构。对较大胎儿组织加冰醋酸2~3%，再大加5%。染液改为100ml加0.1N硝酸2ml，36℃浸2~10h。 第四节 神经原纤维 一、冰冻切片 神经原纤维存在于神经元及其突起中，呈细线状。 试剂： ⑴20%硝酸银水溶液 ⑵20%甲醛液 ⑶氨银液:40%氢氧化钠AR(新配)5滴，10%硝酸银AR水溶液10ml，浓氨水AR约18滴，蒸馏水10ml 徐徐将氢氧化钠水溶液加入硝酸银水溶液中，产生棕黑色沉淀，边滴边摇，替天行道滴16~18滴即可溶解沉淀，最后加蒸馏水至20ml ⑷氯化金水溶液：1%黄色氯化金水溶液3~5滴，蒸馏水10ml ⑸氨水：浓氨水2ml，蒸馏水8ml ⑹极稀的醋酸水 ⑺5%硫代硫酸钠水溶液 方法： ⑴冰冻切片经自来水和蒸馏水几秒钟。 ⑵浸入20%硝酸银水溶液1h。 ⑶20%甲醛液洗几次约10min。 ⑷浸银氨液镜丛至神经原纤维清楚，氨水洗1min。 ⑸用稀醋酸水中和，水洗。 ⑹氯化金调色，蒸馏水洗。 ⑺5%硫代硫酸钠5min，流水洗。 ⑻湿封或经各级酒精，二甲苯透明，封片。 结果：神经原纤维黑色，轴突黑色。 Bielschoesky染色法 方法： ⑴组织固定于甲醛液3~6周。 ⑵切薄组织块，蒸馏水洗几次，流水冲洗24h。 ⑶冰冻切片，水洗。 ⑷浸2%硝酸银液16~24h至切片呈棕色，蒸馏水速洗。 ⑸入银氨液15~20min至切片呈深棕色，蒸馏水洗几次。 ⑹入20%甲醛液洗1次，转入新配的20%甲醛液30min。 ⑺蒸馏水洗直接封片。 ⑻或脱水、透明、封片。 或按上法经氯化金和硫代硫酸钠处理。 结果：神经原纤维黑色。神经胶质细胞亦能显示。 此法组织块甲醛24h，冰冻切片染色，神经原纤维可能着色浅些。 二、石蜡切片 Bielchowsky整块染色法 方法： ⑴组织块固定于10%甲醛液。 ⑵不经水洗，直接入2%硝酸銀水溶液7天。 ⑶将Bielschowsky氨銀液加蒸馏水至100ml浸染1~6h，蒸馏水稍洗。 ⑷入20%甲醛液12~24h，蒸馏水洗。 ⑸常规脱水，透明，石蜡包埋。 ⑹切片脱蜡，封片。 Bielchowsky吡啶整块染色法 方法： ⑴组织经10%甲醛液固定7天，入纯吡啶3天，流水冲洗24h至无吡啶味为止，蒸馏水稍洗。 ⑵37℃恒温箱内浸染于3%硝酸銀水溶液4~5天，蒸馏水洗几次。 ⑶入Bielschowsky氨銀液稀释液过夜（一般24h），蒸馏水洗。 ⑷入10%甲醛液还原30~60min，蒸馏水洗。 常规脱水，透明，石蜡包埋。 Ramon Y Cajal神经原纤维染色法 ⑴取新鲜厚约3mm的脊髓直接浸入1.5~3%硝酸银水溶液3~6天，避光，35℃温箱。蒸馏水洗2次。 ⑵室温下还原24h，蒸馏水速洗。 还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1g，蒸馏水100ml，甲醛5~15nml 焦性没食子酸、对苯二酚用量愈大，分化能力愈强，有时可用2~3g。 ⑶无水酒精脱水24h，媒浸，包埋。 ⑷切片脱蜡，镜检，若染色适当，立即封片；若过染，按下法进行： ⑸切片脱蜡，经下行酒精至水，蒸馏水洗。 ⑹入0.2%氯化金水溶液10~60min，蒸馏水洗。 ⑺经3~5%硫代硫酸钠水溶液30s，充分水洗。 ⑻脱水，透明，封片。 结果：神经原纤维深棕色或近黑色。 此法系块染法，一般易于显示，适合于制作神经原纤维教学标本。 若切片染色太浅，入下液加深： 蒸馏水100ml，硫氰化铵3g，硫代硫酸钠（海波）3g，1%氯化金水溶液若干滴 如浸染过浓，入下液漂白： 高锰酸钾0.5g，浓硫酸1ml，蒸馏水1000ml 处理后，再入1%草酸水溶液漂白，充分水洗。 ⑴组织块固定于95%或无水酒精24h。 ⑵用滤纸或吸水纸吸干组织。 ⑶直接浸入1.5%硝酸银水溶液（避光，35~40℃恒温箱）5~7天，蒸馏水洗。 ⑷按I法处理。 此法对感觉神经末梢特别是有被囊的神经末梢如环层小体、触觉小体显示较好。对于有被囊或无髓神经纤维及小脑梨形细胞的篮状纤维可显示。 ⑴组织块固定于氨-酒精24h。 氨-酒精：95%酒精100ml，浓氨水（28%）1~10滴 由于组织差异，加氨水的量不同。大脑3滴以下；小脑、神经节4滴；神经末梢2~3滴；延髓、脊髓10滴。 有时为避免组织过度收缩，先经70%酒精固定3h，再入氨酒精，或经85%酒精3h再入氨酒精。 ⑵用滤纸或吸水纸吸干。 ⑶浸染于1.5%硝酸银水溶液（35~40℃恒温箱，避光）3~5天。 ⑷其余按I法处理。 此法适用于大多数神经组织，如对脊髓的前角细胞的神经原纤维、脊神经节及交感神经节的突起均可显示。对无髓神经纤维、小脑细胞的篮状纤维可显示。 方法： ⑴组织块固定于10~15%甲醛液6~12h，流水冲洗10h以上。 ⑵浸入氨酒精24h，以滤纸吸干组织表面的氨酒精。 ⑶浸染于1.5%硝酸銀水溶液5天(暗处，38℃恒温箱内)。 ⑷其余同I法。 此法染小脑苔状纤维、细胞突起较佳。一般来说成年动物的较满意。 方法： ⑴Held用纯吡啶固定组织，但由于纯吡啶对组织收缩厉害，Cajal改用吡啶与等量蒸馏水混合液固定6~8h，再转入纯吡啶18~24h，或就在吡啶蒸馏水等量混合液固定24h，不再转入纯啶液。 ⑵流水冲洗至无吡啶味（12~24h）。 ⑶95%酒精24h，用滤纸或吸水纸吸去组织表面酒精。 ⑷于37恒温箱浸入1.5%硝酸銀水溶液4~5天。 ⑸其余步骤同前法。 此法以吡啶为固定液，对神经原纤维显示很好，神经原纤维黑色，背景淡黄色。对再生神经纤维及神经末梢也较合适。 方法： ⑴将组织固定于下液24h，蒸馏水洗短时。 固定液：水合氯醛5.5g，无水酒精25ml，蒸馏水75ml ⑵用滤纸或吸水纸吸干组织。 ⑶浸入氨酒精24h，吸干组织上的酒精。 氨酒精：95%酒精100ml氨水10滴 ⑷浸入1.5%硝酸銀水溶液4~5天（37℃恒温箱）。 ⑸其余步骤同前法。 此法对小脑梨形细胞的篮细胞和苔状纤维及运动终板效果良好。 Bethe甲苯胺蓝染色法 方法： ⑴取兔、狗、牛脊髓（颈、腰膨大处）固定于5%硝酸銀水溶液24h。 ⑵经95%酒精3次共24h。 ⑶入氨酒精24h。 氨酒精：浓氨水10ml，95%酒精80ml，蒸馏水30ml ⑷入95%酒精6h。 ⑸入盐酸酒精溶液24h。 盐酸酒精液：浓盐酸10ml，蒸馏水30ml，95%酒精90ml ⑹95%酒精6h，蒸馏水2~6h。 ⑺入4%钼酸铵水溶液24h。 ⑻95%、无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡切片。 ⑼切片脱蜡，经下行酒精，蒸馏水速洗。 ⑽将切片周边擦干，滴几滴蒸馏水于组织切片上，置60℃温箱5min。 ⑾入极稀的甲苯胺蓝水溶液（3%甲苯胺蓝1ml加水至100ml）染色10min（60℃温箱内），蒸馏水洗去浮色。 ⑿直接入无水酒精脱水，透明，封片。 结果：神经原纤维深紫色。 第五节 尼氏体 尼氏体存在于神经元胞质内，粒状或块状，易被碱性染料如苏木精、结晶紫、硫堇、甲苯胺蓝、派若宁、焦性没食子蓝染色。其形状、数量和分布因细胞而异。脊髓灰质中的神经元尼氏体呈块状，似虎皮样，称虎斑；脊神经节的神经元尼氏体则呈小颗粒状分布于细胞质。因生理状态而改变。正常情况下，尼氏体大而多；反之，尼氏体减少或消失。取材应新鲜。 固定液可用Bouin液、Carnoy液、酒精甲醛液、10%甲醛液。 Nissl染色 方法： ⑴组织固定于80%酒精、Carnoy液、中性甲醛或甲醛生理盐水溶液。 ⑵石蜡切片8~10㎛（火棉胶切片15~20㎛）。 ⑶石蜡切片脱蜡下行至水，蒸馏水洗。 ⑷焦油紫液染色20~30min（60℃温暖 箱染3~10min），蒸馏水洗。 焦油紫液：焦油紫0.1g，蒸馏水99ml，1%冰醋酸水溶液 1ml ⑸95%酒精分色或用下列分色液分色 95%酒精90ml，氯仿10ml，冰醋酸1~3滴 ⑹无水酒精数次，二甲苯充分洗涤除尽酒精。或分色后经氯仿、二甲苯脱水透明。 ⑺树胶封片，盖片。 结果：尼氏体紫色，细胞核淡紫色。 焦油坚牢紫（Cryesyl Fast violet）及硫堇可代替焦油紫。硫堇更适于酒精固定的组织。切片分色可在0.1%伊红95%酒精液进行，纤维等染成淡红色。Einarson（1932）提出没食子酸青（棓酸青蓝Gallocyanin）法染色及其后的许多改变法显示尼氏体，尼氏体呈灰蓝色，但不够鲜艳，不易褪色。其它染料如天青（Azur）、派若宁（Pyronin）等也能染尼氏体。火棉胶切片，可钭染液用1%醋酸水溶液1：10稀释，染色过夜，水洗，分色。 方法： ⑴标本切块，流水冲洗24h，石蜡或火棉胶切片。 ⑵硫堇-安尼林液染色过夜。 硫堇-安尼林液：安尼林油1ml，无水酒精10ml，充分摇荡后加蒸馏水至100ml，再加硫堇0.25g。 ⑶安尼林酒精液（安尼林油25ml，95%酒精25ml）分色至尼氏体清晰，背景淡蓝色为止。如分色反应太慢，可略加大95%酒精体积，或在下液分色可稍快： ⑷木馏油50ml，白柴油40ml，二甲苯50ml，无水酒精150ml ⑸二甲苯两次，加树胶封片。 结果：尼氏体深蓝色，核仁紫蓝色，细胞质淡蓝色。 Killer焦油紫染色法 试剂： 焦油紫0.5g，蒸馏水100ml 方法： ⑴石蜡切片10㎛，太薄显示尼氏体不佳。 ⑵切片脱蜡至水。含升汞固定者，应脱汞后入水。 ⑶焦油蓝液染色3~5min，蒸馏水洗几次各几秒钟。 ⑷95%酒精脱水30s，二甲苯1min。 ⑸二甲苯中性树胶混合液2min。 ⑹镜检分色于无水酒精10~30s，透明，封片。 结果：尼氏体紫色。 试剂： ⑴固定液：Bouin液或其它固定液（除Zenker液） ⑵硫堇液：硫堇0.25g溶于0.55%碳酸锂水溶液100ml 方法： ⑴石蜡切片10㎛。 ⑵切片脱蜡至水。切片有汞者应脱汞再入水。 ⑶入碳酸锂溶液5min。 ⑷硫堇液5~10min，蒸馏水洗。 ⑸70%酒精几秒。 ⑹正丁醇脱水两次各2~3min。 ⑺透明，封片。 结果：尼氏体蓝色。 Einarson没食子蓝法 试剂： ⑴固定液：任何常用固定液 ⑵没食子蓝液：铬明矾溶于热水100ml，加没食子蓝（gallocyanin）0.15g，煮沸。可用7天。 方法： ⑴石蜡切片10㎛。 ⑵切片脱蜡至水。含汞者脱汞入水。 ⑶没食子蓝液过夜，流水洗5min。 ⑷脱水，透明，封片。 结果：尼氏体蓝色。 试剂： ⑴硫堇液：硫堇1g，50%酒精250ml ⑵2%石炭酸：石炭酸水溶液300ml，硫堇液60ml 方法： ⑴切片脱蜡至水。 ⑵石炭酸硫堇液10min。 ⑶80%酒精分色。 ⑷无水酒精脱水，二甲苯透明，封片。 结果：尼氏体紫色至紫红色。 尼氏体主要取材于脊髓，固定液用10%甲醛液，Bouin液，甲醛酒精液，染色用0.5~1%硫堇及甲苯胺蓝水溶液，1%派若宁水溶液加石炭酸结晶0.25g。在分色和脱水。低浓度酒精（80%以下）不宜久放，必要时用吸水纸吸干 ，直接入无水酒精，然后透明、封片。 第六节突触 一个神经元轴突末端与另一个神经元细胞体或树突接触处称为突触。 显示脊髓突触的常用方法有Cajal Ⅳ法，Bpdian蛋白银法，不易掌握，染出的突触不多。1956年，Wychoff与Young用甲酸灌注动物，固定后，用Bielschowsky-Gros改良法染色，染出的突触极多。鲍蓉、鲁子惠等用高尔基-坚聂克法地动物脊髓染出的突触很多，方法简便，易于掌握。 高尔基-坚聂克原法 试剂： ⑴固定液：AFA：95%酒精30ml，20%甲醛30ml，亚砷酸饱和液30ml ⑵还原液：对苯二酚2g，亚硫酸钠0.5g，甲醛5ml，蒸馏水95ml ⑶显色液：硫氰化铵、硫代硫酸钠各1.5g，溶于蒸馏水50ml，加1%氯化金水溶液5ml 方法： ⑴AFA固定20~90min，用滤纸或吸水纸吸干组织块。 ⑵室温下浸2%硝酸银水溶液暗处18天或更长，蒸馏水洗1~3min。 ⑶还原24h，蒸馏水洗。 ⑷酒精脱水，乙醚酒精24h，常规火棉胶包埋，切片。 ⑸火棉胶切片水洗，入显色液至切片变黑。 ⑹自来水洗，蒸馏水洗。 ⑺入高锰酸钾液处理1~10min 高锰酸钾2g，蒸馏水50ml，浓硫酸1滴 ⑻1%草酸1~3min，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。 鲍鲁等在还原后，按常规石蜡包埋，效果亦佳。 将猫颈部切开，从颈动脉灌注10%甲酸液，直到从另一侧颈动脉回流出清亮甲酸液为止（约需500~800ml溶液），然后取腰膨大和颈膨大部的脊髓入AFA液固定，石蜡包埋，切片6㎛，特别是靠近组织中心的切片，结果令人满意。 第五章 神经胶质细胞周围神经系统的神经胶质细胞如神经节内的卫星细胞和周围神经的Swan细胞，HE染色即可辨认。中枢神经系统的神经胶质细胞，如星形胶质细胞（包括纤维性星形胶质细胞和原浆性星形胶质细胞）在HE染色中，只能根据细胞核大小和着色深浅区分，星形胶质细胞核最大，圆形或椭圆形，染色较淡；少突胶质细胞核较小，圆形，染色质密；小胶质细胞核最小，染色最密，染色最深。 Mallory磷钨酸苏木精染色法 方法： ⑴固定以Zenker液为佳。 ⑵常规石蜡切片。切片脱蜡、脱汞后入水。 ⑶入0.25%高锰酸钾水溶液5~15min，蒸馏水洗。 ⑷5%草酸水溶液5~15min，流水洗。 ⑸入Mallory磷钨酸苏木精染色12~24h。 磷钨酸苏木精：苏木精0.1g，磷钨酸2g，蒸馏水100ml 苏木精溶于热水，再加磷钨酸，冷却后15天以上即可用。 ⑹95%酒精分色兼脱水，镜检。 ⑺无水酒精脱水，透明，封片。 结果：神经胶质细胞及核蓝色，结缔组织红色。 Ramon Y Cajal氯化金升汞法 试剂： ⑴固定液：甲醛15ml，溴化铵2g，蒸馏水85ml ⑵氯化金升汞液：结晶状升汞0.5g，1%氯化金水溶液6ml，蒸馏水35ml 用时配制。玻璃瓶用清洁液洗净。将升汞研成粉末，加入蒸馏水，逐渐加温溶解，再加入氯化金水溶液。 ⑶石炭酸-二甲苯-木馏油混合液：木馏油10ml，石炭酸10ml，二甲苯80ml 方法： ⑴取薄小组织固定于下液(37℃)1天。 ⑵冰冻切片15㎛。 方法： ⑴将切片放入1%甲醛液，蒸馏水速洗两次。 ⑵转入新配制的氯化金升华液4~6h（室温，暗处）。当切片出现紫色时，及时镜检，如见星状细胞，转入下液。最好切片转入经清洁液洗涤的染色缸染色。 ⑶蒸馏水洗5~10min。 ⑷5%硫代硫酸钠水溶液固定5~10min，充分水洗。 ⑸摊于载玻片上，用吸水纸吸干压平。 ⑹95%酒精脱水。 ⑺转入石炭酸-二甲苯-木馏油混合液脱水、透明，再用二甲苯先几次，封片。 结果：星形胶质细胞及其突起黑色，背景不着色或紫褐色，神经元淡红色，神经纤维不着色。 此法染少突胶质细胞操作如下： ⑴组织固定后，浸入95%酒精36~48h，水洗后冰冻切片。 ⑵强碳酸弱液染色15min或更长直到切片呈棕色为止，蒸馏水洗几秒钟。 ⑶还原、调色，同原法。 ⑶脱水，透明，封片。 结果：少突胶质细胞黑色。 Del Rio –Horlega改良法（Penfield） 试剂： ⑴固定液：10%福尔马林，甲醛-溴化铵液(甲醛14ml，溴化铵2g，蒸馏水86ml) ⑵Globus氢溴酸液:40%氢溴酸5ml，蒸馏水95ml ⑶碳酸銀液：10%硝酸銀水溶液5ml内加入碳酸钠水溶液20ml，立即产生乳白色沉淀，一滴一滴加入浓氨水直到沉淀刚好溶解，加蒸馏水至45ml（强液）或75ml（弱液），过滤使用。可较长时间保存于棕色瓶内。 方法： ⑴组织块固定7天或更长，水洗，冰冻切片20㎛。 ⑵将切片放入1%甲醛液或蒸馏水。 ⑶1%氨水过夜，将盖盖好，防止氨气溢出。 ⑷将切片放于氢溴酸水溶液38℃恒温箱内1h，蒸馏水洗3次。 ⑸媒染于5%碳酸钠水溶液1h。 ⑹浸染于弱碳酸銀水溶液3~5min。 ⑺还原于1%甲醛液，蒸馏水洗。 ⑻0.2%氯化金水溶液调色至灰色。 ⑼5%硫代硫酸钠水溶液固定3min，流水洗5min。 ⑽脱水，透明，封片。 结果：少突胶质细胞和小胶质细胞深灰至黑色。 如只染多突胶质细胞，只需固定2天。长时间固定将增加小胶质细胞和星形胶质细胞染色。 第六章 神经纤维和神经末梢第一节神经纤维 固定液（Bodian液）：甲醛5ml，冰醋酸5ml，80%酒精90ml。 方法： ⑴常规石蜡切片，切片脱蜡至水。 ⑵浸染于100ml蛋白銀水溶液（加纯銅5g，经3份盐酸和1份硝酸处理过的銅电线、銅炮弹壳或銅片），在37℃恒温箱12~24h。蒸馏水洗几次。 ⑶还原5~10min，蒸馏水洗3次共1min。 ⑷氯化金水溶液调色4min，蒸馏水洗3次共3min。 ⑸2%草酸水溶液处理3min，镜检至背景为灰色而纤维显示为止，蒸馏水洗3次各1min。 ⑹5%硫代硫酸钠水溶液固定5min，流水洗5~10min，蒸馏水洗。 ⑺醋酸水处理5min。 ⑻脱水，透明，封片。 结果：神经纤维黑色。 Foley认为，为区别神经组织或非神经组织，复染是必要的。一般在醋酸水处理前进行。 ⑺没食子蓝水溶液（5%铬明矾水溶液加没食子蓝0.15g）过夜，流水洗5~10min。 ⑻5%磷钨酸水溶液媒染30min。 ⑼直接染色于下液的稀释液（20ml加蒸馏水30ml）1h。 染液：苯胺蓝0.1g，快绿FCF 0.5g，橘黄G 2g，蒸馏水92ml，冰醋酸8ml ⑽70%、95%酒精分色。 ⑾脱水、透明、封片。 组织固定1~3天。固定24h后换新液，特别是大块组织、带脂肪的组织。 固定液：水合氯醛25g，50%酒精100ml 氨酒精：95%酒精60ml，浓氨水 4滴 方法： ⑴将组织块固定液吸干，转入氨酒精24h，至少换一次液。蒸馏水洗5min。 ⑵暗处37~40℃浸2%硝酸銀水溶液5~6天，每2天换一次新液。蒸馏水洗2~3min。 ⑶还原，蒸馏水洗几次共2~3h。 还原液：焦性没食子酸2.5~3g，甲醛8ml，蒸馏水100ml ⑷经50%酒精2次共24h。 ⑸脱水，透明，石蜡包埋。 ⑹切片脱蜡，透明，封片。 结果：神经纤维和神经末梢棕色至黑色。 ⑴以10%水合氯醛灌注固定后取材，组织块厚度5~8mm，再入10%水合氯醛固定1~2h。 ⑵组织块用20~40%吡啶水溶液处理2天，蒸馏水洗1~2h（不得超过）每30min换一次蒸馏水。 ⑶浸染于1.5%硝酸銀水溶液3~7天，蒸馏水洗20~30min，换一次蒸馏水。 ⑷2%焦性没食子酸水溶液5h。 ⑸脱水，透明，石蜡包埋。 ⑹切片15~20㎛，摊于载玻片上。 ⑺切片常规脱蜡至水，用氯化金调色。 ⑻脱水，透明，封片。 结果：神经纤维和神经末梢黑色，神经元灰黄色至棕色。 Davenport指出，由主动脉灌注水合氯醛大约1~3min可达全身。 组织经銀染后水洗应十分注意，如果表面洗得不够充分则会过染。 染液： 銀液1：硝酸銀1.5g，蒸馏水100ml，吡啶5ml 銀液2（氨銀液）：硝酸銀0.45g溶解于蒸馏水20ml，再加入95%酒精10ml。用吸管滴入浓氨水2ml和氢氧化钠2.2ml，彻底混合，密封保存，防止氨气溢出。 还原液：10%酒精45ml，10%甲醛2ml，1%枸橼酸1.5ml 方法： ⑴固定：10%甲醛固定14天至半年。 ⑵冰冻切片15~20㎛。 ⑶将切片置于1%氨酒精（50%酒精99ml加氨水1ml）脱髓鞘6~12h（不超过12h），蒸馏水洗3次各几秒钟。 ⑷硝酸銀液浸染12~24h。 ⑸直接入还原液至切片呈金黄色或黄色。 ⑹浸于2.5%硫代硫酸钠水溶液1~3min，蒸馏水洗3次。 ⑺迅速脱水，透明，封片。 结果：神经纤维和末梢黑色，细胞浅黄色至棕色。 Ranson吡啶銀法显示无髓神经纤维 方法： ⑴组织固定于氨酒精48h，水略洗。 氨酒精：无水酒精100nl，浓氨水1ml，或95%酒精100ml，浓氨水5ml ⑵纯吡啶24h，充分水洗1天。 ⑶2%硝酸銀液3天，暗处，35℃，水略洗。 ⑷还原液24~48h，水洗。 还原液：焦性没食子酸4g，5%甲醛液100ml ⑸常规石蜡包埋切片，切片贴片烘干，切片脱蜡加树胶封片。 结果：对较大块组织色泽较均匀，显示各种神经节良好，胞体黄棕色，突起黑色。无髓神经纤维黑色，有髓神经纤维黄棕色。 取青蛙坐骨神经一段，用线将两端结扎于细木条或玻棒上。入0.5%锇酸水溶液24h。取下坐骨神经，用蒸馏水洗约30min。将用线结扎的部分剪掉。入70%酒精24h加深颜色。经各级酒精脱水，透明，石蜡包埋。 亦可固定后用蒸馏水洗，入甘油2h，制成分离标本，用甘油明胶封固。 结果：髓鞘黑色，轴突淡按劳取酬，Ranvier结、施兰切迹和神经鞘清晰显示。 用狗坐骨神经较佳。结扎时勿将坐骨神经拉得过紧，否则切迹不清晰。亦可用1%锇酸水溶液浸泡。 Ranvier结石蜡切片法 取哺乳动物细神经或青蛙坐骨神经，将两端用线结扎于木条上，浸于1%硝酸銀水溶液24h，蒸馏水洗短时，经各级酒精脱水，透明，石蜡包埋。 第二节 髓鞘和变性髓鞘 脑脊神经中大多数为有髓神经纤维，其图财害命表面包有一层节段性鞘称髓鞘。髓鞘含40%蛋白质，其余为类脂质。HE染色中，髓鞘因被酒精、二甲苯等脂溶剂溶解而呈空泡状，有时可见一些网状的蛋白质染成红色。 方法： ⑴组织块固定于10%甲醛液几天至几周。 ⑵将固定的组织修至2cm厚，于Weigert媒染液浸染10天左右至20天 媒染液：重铬酸钾5g，氟化铬2.5g，蒸馏水100ml 混合后煮沸，过滤后使用。 也可与福尔马林混合使用：40%福尔马林1份，媒染液9份。具固定兼媒染作用。 无氟化铬，可用5%重铬酸钾水溶液，需浸泡1个月左右至白质呈浅棕色为止。 ⑷转入下列媒染液24~48h，火棉胶切片仅24h。70%酒精稍洗。 媒染液：醋酸銅5g，36%醋酸水溶液5ml，2.5%氟化铬水溶液100ml ⑸铁苏木精染色24h或碳酸锂苏木精染色2~12h，充分水洗。 铁苏木精：29%氯化铁水溶液4ml，蒸馏水96ml，1%苏木精（95%或无水酒精）溶液100ml 碳酸锂苏木精：10%苏木精酒精液10ml，饱和碳酸锂水溶液1ml，蒸馏水100ml。 10%或1%苏木精以成熟者为佳，提前一个月配制。 ⑹分色镜检至髓鞘显示为止约30min左右，充分水洗。 Weigert分色液：硼砂2g，铁氰化钾（赤血盐）2.5g，蒸馏水100ml ⑺脱水，透明，封片。 结果：髓鞘蓝黑色或黑色。 Well法 方法： ⑴组织块固定于10%甲醛液。 ⑵常规石蜡包埋，切片10~15㎛。 ⑶切片入铁明矾苏木精染色55℃温箱20min后，室温下染色10min，流水冲洗。 铁明矾苏木精：成熟10%苏木精酒精液（提前半年配制）10ml，蒸馏水90ml，4%铁明矾水溶液100ml。用后弃之 ⑷入4%铁明矾水溶液液分色至背景基本无色，流水冲洗。 ⑸入下液分色，镜检至髓鞘清楚。 分色液：硼酸1g，铁氰化钾1.25g，蒸馏水100ml ⑹流水充分洗涤或入极稀的氨水（蒸馏水100ml加浓氨水6滴）30s，蒸馏水洗。 ⑺脱水，透明，封片。 结果：髓鞘深蓝色。 Spielmeyer法染冰冻切片 方法： ⑴将经甲醛液固定并经水洗后的组织切片，蒸馏水洗。 ⑵媒染于2.5%铁明矾水溶液6h或更长，蒸馏水洗。 ⑶转入70%酒精。 ⑷苏木精染色10~24h，蒸馏水洗。 10%苏木精酒精液（成熟）5ml，蒸馏水100ml ⑸铁明矾水溶液分色，镜检。 ⑹蒸馏水洗2次，流水洗1~2h。 ⑺脱水、透明、封片。 结果：髓鞘蓝黑色至黑色。 试剂： ⑴固定：任何常用固定液。 ⑵染液：Luxol fast blue 0.1g，95%酒精100ml，10%醋酸0.5ml ⑶0.5%高碘酸水溶液 ⑷0.05%碳酸锂水溶液 ⑸Schiff试剂 ⑹亚硫酸水：10%偏重亚硫酸钾或钠5ml，1N盐酸5ml，蒸馏水100ml 或浓盐酸1ml，偏重亚硫酸钾或钠0.4g，蒸馏水100ml。用时配制。 ⑺Papamiltiades苏木精：苏木精5g，无水酒精50ml，钾明矾或铵明矾100g，蒸馏水1000ml，氧化汞2.5g。将苏木精溶于酒精，钾矾或铵矾溶于蒸馏水煮沸溶解。二液混合煮沸，去火，慢慢加入氧化汞，溶液呈深紫色。 方法： ⑴常规石蜡包埋切片。 ⑵切片脱蜡至95%酒精。如系含汞固定液固定，应去汞。 ⑶Luxol fast blue液染色，60℃过夜。 ⑷95%酒精洗去浮色，蒸馏水洗。 ⑸碳酸锂水溶液15s。 ⑹70%酒精分色20~30s，蒸馏水洗。 ⑺入碳酸锂水溶液20~30s。 ⑻70%酒精分色20~30s，蒸馏水洗。如分色不够，重复碳酸锂和70%酒精两步。 ⑻过碘酸液氧化5min，蒸馏水洗2次各5min。 ⑼室温下经Schiff试剂处理15~30min。 ⑽亚硫酸水洗3次各2min，流水洗。 ⑾苏木精染色3min，流水洗5min或更长（如背景着色，可用盐酸酒精分色，如细胞核着色不深，可用极稀氨水处理，然后水洗）。 ⑿脱水，透明，封片。 结果：髓鞘蓝或绿色，PAS阳性物质红色，细胞核蓝色。 试剂： ⑴固定液：10%福尔马林 ⑵染液：20%硝酸銀水溶液：硝酸銀20g，蒸馏水100ml ⑶硼酸液：硼酸12.4g，蒸馏水1000ml ⑷硼砂液：硼砂19g，蒸馏水1000ml ⑸浸染液：在500ml量筒中加入硼酸溶液55ml和硼砂溶液45ml，用蒸馏水稀释至494ml。用吸管加入1%硝酸銀水溶液1ml，用另一吸管加入10%吡啶水溶液5ml，充分混合。 ⑹⑸还原液：对苯二酚1g，结晶硫酸钠10g，蒸馏水100ml。可重复使用几天。 方法： ⑴石蜡包埋切片，切片脱蜡至水。 ⑵避光室温浸20%硝酸銀水溶液1h，蒸馏水洗3次各10min。 ⑶37℃温箱内浸染过夜， ⑷抹去过多的浸染液，入还原液2min，流水洗3min，蒸馏水洗。 ⑸入0.2%氯化金水溶液3min，蒸馏水洗。 ⑹入2%草酸水溶液3~10min至轴突呈清楚的黑色，蒸馏水洗。 ⑺5%硫代硫酸钠水溶液固定3min，流水洗。 ⑻入Luxol fast blue染液过夜。 ⑼95%酒精洗，蒸馏水洗。 ⑽入0.05%碳酸锂水溶液15s。 ⑾70%酒精分色20~30s，蒸馏水洗。 ⑿如需要，可反复使用碳酸锂和酒精洗涤。 ⒀脱水，透明，封片。 结果：髓鞘绿蓝色，轴突黑色。 苏丹黑B染色法 方法： ⑴组织经10%醛固定3天以上，蒸馏水洗，冰冻切片。 ⑵经30%、50%、70%酒精。 ⑶入1%苏丹黑B液染色0.5~15h。 苏丹黑B液：苏丹黑B1g，70%酒精100ml。提前1天配制。用时过滤。 ⑷经50%酒精至水。 ⑸甘油或甘油明胶封片。 结果：髓鞘蓝至黑色。 当神经元受伤或神经被切断后，细胞体和突起发生溃变反应。神经纤维切断几小时后，细胞体肿胀，细胞核移到一侧，尼氏体消失，细胞浆中央部分染色很淡，称为染色质溶解现象。在轴突受伤两周内达到最高峰。近细胞体端与远细胞体端将发生溃变，特别是远细胞体端全段发生溃变，髓鞘发生断裂，在几周内崩溃分解为大小不等的脂滴。由于髓鞘的类脂质发生质变。一般用锇酸染成黑色显示髓鞘。 Marchi锇酸法 方法： ⑴固定：在10%甲醛液加入1%氯酸钾固定24~48h。Swank和Davenport认为固定时间不宜过长。 ⑵将组织块修至3mm厚，放入2.5%重铬酸钾水溶液暗处铬化1~7周，换两次新液。 ⑶直接浸入Marchi液1~2周。溶液的量为组织块的15~20倍。浸渍时间长短决定于组织块的大小。最好每天翻动组织块以利浸透。 Marchi液：0.5%锇酸水溶液11ml，1%氯酸钾水溶液16ml，福尔马林3ml，10%醋酸水溶液3ml，蒸馏水67ml ⑷流水洗24h。 ⑸脱水与包埋：火棉胶包埋，应尽量缩短脱水、媒浸和包埋时间；石蜡包埋，避免用二甲苯透明改用氯仿透明，整个过程尽量缩短。 ⑹氯仿脱蜡、氯仿配制的树胶封片。 结果：变性髓鞘黑色，背景棕黄色，中性脂肪黑色。 Donaggio苏木精法 方法： ⑴固定：在10%甲醛液加入1%氯酸钾固定小块组织3个月。 ⑵常规火棉胶包埋，切片15㎛。 ⑶切片经70%酒精，迅速入水。 ⑷氯化锡苏木精染色10~30min，流水洗。 氯化锡苏木精：5%苏木精水溶液10ml，1%氯化锡水溶液90ml 先将蒸馏水加热，加入苏木精溶解冷却，再加氯化金水溶液。 ⑸入2.5%高锰酸钾水溶液30s，蒸馏水洗。 ⑹入下液分化30~180s，流水洗数分钟，蒸馏水洗。 ⑺常规脱水，透明，封片。 封片以下液为佳：达玛脂12g，二甲苯10ml，石油醚10ml 待达玛脂溶于二甲苯后，再加石油醚。 结果：变性髓鞘（变了质的类脂质）红紫色，正常髓鞘不着色。 此法最大优点是只染变性髓鞘。 第三节 溃变纤维 方法： ⑴中枢神经系统受损后14~20天，以过量巴比妥注入动物腹腔，由左心室注入下液： 无水硫酸镁40~80g。重铬酸钾20~30g，蒸馏水1000ml 硫酸镁的浓度影响色调，量多色浓。 不可用生理盐水冲洗血管，否则在染色时造成产生大量人为假象。按动物大小注入一定量后根据需要部位取材。 ⑵切取不厚于3mm的组织，用10%甲醛固定48h。 ⑶在下液染色1~2周，流水冲洗12~24h。液体量大于组织20倍。染色时间换液2~3次并经常摇荡。 1%氯酸钾水溶液60ml，1%锇酸水溶液20ml，冰醋酸1ml，甲醛12ml ⑷火棉胶或石蜡切片。 ⑸切片经70%酒精，在95%酒精-正丁醇等量混合液分色。 ⑹95%酒精、正丁醇脱水，氯仿透明，以氯仿溶树胶封片。 结果：溃变纤维的髓鞘黑色，背景淡黄色。 此法较Marchi原法节省锇酸，所示对比度好。脱水、透明、包埋时间尽量缩短。 方法： ⑴组织固定于10%甲醛2月至半年，，第1个月内换液二次。 ⑵冰冻切片30~50㎛。可切成不同厚度（25~50㎛），加以选择。如一时处理不及，贮存于冰箱可较长时间不变质。 ⑶切片置入10%甲醛液内。 ⑷镀银时每次以数片如5~20片为宜，略水洗。 ⑸浸入0.5%磷钼酸水溶液15~30min，速洗。 ⑹入0.025~0.05%高锰酸钾水溶液，分别以切片处理5、10、15min，控制未溃变纤维。如时间过短抑制不足，时间过长可使溃变纤维不易銀染而受抑制。如用0.025%高锰酸钾，对时间控制幅度较大，容易掌握。切片厚薄与作用时间有关。长时间固定的组织，处理时间短些。 ⑺在等量1%草酸和对苯二酚混合液内消色至少2min，蒸馏水充分洗。虽然可能不到1min即消色，但给以加倍时间会使消色更彻底。 ⑻经1.5%硝酸銀水溶液15~30min，水洗2次。以后均应逐片处理。 ⑼在Laidlaw銀液内，切片应不停摇荡45~60s。 Laidlaw銀液：用250ml量杯硝酸銀12g于双蒸水20ml中。 用230ml饱和碳酸锂水溶液（9℃为1.33%CP）立即产生沉淀，摇荡。 待沉淀下沉至70ml刻度时小心倾去上清液，再加蒸馏水至250ml刻度处，再摇动。静止，待沉淀下沉至70ml刻度处，再次倾去上清液。如此清洗沉淀3次。 待沉淀下沉至70ml刻度处，小心倒去上清液。边摇加慢慢滴加浓氨水至溶液几乎透明为止（氨水约9.5ml，多于9.5ml）。勿加多。配好后略有氨味。 用蒸馏水稀释至120ml，过滤于洁净瓶内，置白昼光下至少2周，遂见瓶壁出现一层銀镜反应。用前过滤。 ⑽切片直接入还原液，不断轻摇，勿使切片沉底不动，约1min，切片还原成棕色，直到2min为止。水速洗。如还原时间过久，颜色太暗，可在每20ml銀液内加氨水4滴；如颜色太淡，加数滴2.5%氢氧化钠于銀液中。 ⑾浸于1%硫代硫酸钠水溶液1min，蒸馏水洗数次。 ⑿用Albercht明胶酒精法封片。 切片经蒸馏水洗后，入1.5%明胶-80%酒精等量混合液约5min。将切片捞在载玻片上，用新滤纸略吸干。入95%酒精凝固明胶。 ⒁脱水，透明，封片。 结果：粗细不一的溃弯纤维染成黑色，背景黄褐色。仍有一些正常轴突染呈黑色。溃变纤维所终止的细胞可见有溃变的细胞周围或树突周围纤维。胞体及树突俯首帖侧端染成淡褐色。某些溃变纤维染色不能令人满意，如小脑的溃变攀援纤维等。 Fink-Heimer（1967） 本法能选择性地显示溃变的轴突和突触末梢，以硝酸铀代替氨銀，抑制正常纤维达到最少量。 方法： ⑴先用生理盐水灌注动物，再用10%甲醛或甲醛生理盐水灌注，小心取材，固定于10%甲醛1~2周。 ⑵切取组织块浸于30%蔗糖水溶液2~3天或稍长，开始时组织块漂浮于蔗糖液上。 ⑶不用水洗，冰冻切片15~30㎛。 ⑷入1%甲醛液内（轴蔗糖液内取出的组织块不易冷冻），略水洗。 ⑸浸于0.05%或0.025%高锰酸钾水溶液5~15min，水洗。 ⑹在1%草酸-对苯二酚等量混合液漂白30~60min，蒸馏水充分洗。 ⑺转入下液30~60min 0.5%硝酸铀10ml，2.5%硝酸銀12ml，蒸馏水28ml ⑻直接转入下液30~40min，充分水洗。 0.5%硝酸铀20ml，2.5%硝酸銀30ml ⑼转入新配的下液1~5min。 2.5%硝酸銀30ml，浓氨水1ml，2.5%氢氧化钠1.8ml ⑽不经水洗，直接转入Nauta-Gygax还原液两缸（每缸1~2min），水洗。 还原液：蒸馏水910ml，95%酒精90ml，10%甲醛27ml，1%枸橼酸27ml ⑾入0.5%硫代硫酸钠水溶液1min，水洗。 ⒀常规脱水，透明，封片。 结果：中枢神经系统溃变纤维及其突触终末黑色。 Ebbesson-Robinson双重銀法(1970) 方法： ⑴动物手术后，经存活期3~7天。 ⑵先用生理盐水灌注动物，再用10%甲醛或甲醛生理盐水灌注，小心取材，固定于10%甲醛2周以上，水洗。 ⑶20~25%明胶包埋.以明胶短时包埋作支持剂，无需浸透。 ⑷冰冻切片20~40㎛。切片集中于10%甲醛液内。 ⑸切片经蒸馏水换洗1~2h。 ⑹0.2%硝酸铀水溶液7h，水洗3次共10min。 ⑺0.01%高锰酸钾水溶液约12h，最初1h换新液，以后经常摇荡，切片最后呈棕色。 ⑻蒸馏水洗若干次共10min。 ⑼对苯二酚-草酸液漂白约1min，蒸馏水换洗若干次共10min。 1%对苯二酚1份，1%草酸1份。用前混合 ⑽0.5%硝酸银水溶液避光浸30min。 ⑾切片分别入2次氨银液，不断摇动，共2~4min。 1.5%硝酸银水溶液60ml，无水酒精36ml，2.5%氢氧化钠水溶液50~54ml，浓氨水10ml 先以无水酒精加入硝酸银摇荡，滴加氢氧化钠，发生棕黑色沉淀。再用浓氨水滴入，使沉淀恰好消失。 ⑿切片不洗，入两缸还原液。第一次略荡后在第二缸内约2min，背景呈金黄色。水洗。 蒸馏水400ml，10%甲醛液10ml，1%枸橼酸水溶液15ml，无水酒精50ml，菲尼酮（Phenidone）0.1g ⒀1%硫代硫酸钠水溶液1min，水洗10min。可将切片贴于涂有蛋白甘油的载玻片上略烘干，经95%酒精等上行脱水，透明，树胶封片。 结果：背景金黄色。核群的神经元胞体轮廓清晰。有少量正常纤维呈黄棕色，镜检很容易鉴别。纤维的溃变成分为黑色串珠状、断线状或粉尘样银粒沉淀。 本法易于掌握，重复性满意。固定时不必用中性甲醛，硝酸铀有加强溃变纤维成分的镀银性，高锰酸钾抑制正常纤维银染作用。氨银染色很关键。氢氧化钠量多时着色偏深，氨水量多时不易着色。菲尼酮有助于显示溃变成分的微细结构，配制时可能产生沉淀，但对染色无碍。 第四节 神经末梢 蚁酸-氯化金法 方法： ⑴取小白鼠或豚鼠腓肠肌固定于20~25%蚁酸5min至组织透明。 ⑵倒去蚁酸，将组织吸水纸吸干。 ⑶入1%氯化金水溶液20~30min，吸干。 ⑷置强光或100W反光灯下照射直到变成棕色。 ⑸于暗处还原于25%蚁酸12~36h，镜检控制。 ⑹入纯甘油软化24h或更长，组织保存于甘油中，用时用甘油封片。 ⑺还原可改用极稀的醋酸水（每100ml蒸馏水加冰醋酸4~5滴）处理。 Lowit蚁酸法 方法： ⑴取1mm厚组织（爬虫类肋间肌，哺乳类、两栖类）入下液10~20min直到透明。 蚁酸1份，蒸馏水2份 ⑵直接入1%氯化金水溶液1h。 ⑶入上述蚁酸液还原6~12h.（换新液）。 ⑷镜检见运动终板后，立即转入蒸馏水洗，多洗件次，洗净蚁酸。 ⑸甘油或甘油明胶封片。 结果：运动终板蓝黑色，肌肉红色。 此法用于染手指掌皮和阴茎龟头，制作石蜡切片，显示触觉小体颇佳。 注意：还原时要经常镜检，以显示运动终板为度。如丰还原过长或洗酸不净，肌肉显蓝色，背景过深，不利于观察。蚁酸须充分，否则还原不足。也能显示运动终板。氯化金较贵，以淹没组织为度。封片以甘油明胶封片，再在周边以漆封固。 蚁酸-氯化金法 方法： ⑴年轻小兔（出生1月左右），空气针注射致死，取下全部肋间肌，将肋间肌上的结缔组织剥离干净，用针在两端穿小孔，以线将其拉平摊于清洁的载玻片上。 ⑵入25%蚁酸水溶液40min，吸水纸吸干。 ⑶用手撕成小块（每一条肋间肌为一块），转入1%氯化金水溶液1h，吸干。 ⑷再入15%蚁酸水溶液还原约20~24h，自来水洗净蚁酸。 ⑸蒸馏水洗5~6次。 ⑹转入纯甘油24h，换新甘油封片。 所有玻璃器皿必须很干净。从氯化金取出时，应避光，还原过程应在暗处避光进行。 蚁酸-氯化金法 方法： ⑴将猫的第二、三肋间肌剪成火柴头大小，固定于20~25%蚁酸5min至组织透明。 ⑵倒去蚁酸，将组织吸水纸吸干。 ⑶入1%氯化金水溶液20~30min，吸干。 ⑷置强光或100W反光灯下照射直到变成棕色。 ⑸于暗处还原于25%蚁酸12~36h，镜检控制。 ⑹入纯甘油软化24h或更长，组织保存于甘油中，用时用甘油封片。 此法可用于显示肌梭，取小白鼠或豚鼠腓肠肌按此法处理。如猫的肠系膜则显示环层小体。还原可改用极稀的醋酸水（每100ml蒸馏水加冰醋酸4~5滴）处理。 Cole法 ⑴取肋间肌放入用生理盐水配制的10%柠檬酸水溶液10~30min。 生理盐水浓度：哺乳类0.9%，爬虫类0.8%，两栖类0.64% ⑵直接转入1%氯化金水溶液60min或更长，直到组织变成深黄色。暗处进行。 ⑶在暗处，将组织直接转入20%蚁酸10~20min（夹取组织时，勿与金属接触），要用玻棒或在金属镊子上涂一层石蜡。 ⑷流水洗。 ⑸转入95%酒精与等量甘油混合液几小时，敞开瓶口，让上部酒精挥发。 ⑹转入甘油。 ⑺将组织分成小块，镜检，甘油封片。 结果：运动终板黑色，肌纤维红色或蓝色。 Gray法 试剂： 过滤的新鲜的柠檬汁；1%氯化金水溶液；0.2%醋酸水溶液；20%蚁酸水溶液；三蒸水；甘油。 方法： ⑴将带有神经的肌肉组织悬浸于柠檬汁2~12h直到透明为止。 ⑵三蒸水洗，倒去蒸馏水，将组织吸干。 ⑶放入1%氯化金水溶液60ml 20min并振荡直到肌肉变成淡棕色。 ⑷用玻璃钩将组织转至0.2%醋酸水溶液冲洗1~2h，肌肉变成淡紫色。 ⑸转入盛有20%蚁酸水溶液的试管暗处2天，加入甘油，甘油沉底，蚁酸浮于上层，肌肉也在上层，24h后，肌肉透过蚁酸-甘油层，下沉至瓶底，直到没有多余的蚁酸从肌肉溢出。 ⑹加入甘油除去蚁酸，直到肌肉浴室到瓶底。 ⑺转入新甘油，分离、压片并封固于甘油明胶。 结果：运动终板红至紫色，神经纤维轴突末梢、脚板和昆氏颗粒等也能显示。 Ranvier蚁酸法 方法： ⑴新鲜小块组织入下液约1h，蒸馏水速洗。 1%氯化金水溶液8ml，蚁酸2ml 将溶液放入25ml试管内，不加盖，用小火焰加温至煮沸立即停止。待液冷酷 冷后再加温，反复加温3次（若质量不好出现黑色沉淀）。冷后将组织放入。浸染皮肤2~4h。 ⑵入用蒸馏水稀释的蚁酸溶液或稀冰醋酸水溶液，放置日光下还原24~48h。 ⑶70%酒精数日。取出组织分成小块，加甘油或甘油蚁酸等份混合液1滴，加盖玻片，稍加压力分散肌纤维，镜下检查.浸染好的标本，可用漆将盖玻片四周封固.(见280) 浸染运动终板多用分离法，保持运动终板完整。对其它神经末梢，须从70%酒精取出组织，脱水，透明，石蜡包埋，切片观察。此法染骨组织效果良好，骨小管呈深紫蓝色，基质紫红色。 蚁酸-氯化金法 方法： ⑴将猫肠系膜固定于20~25%蚁酸5min至组织透明。 ⑵倒去蚁酸，将组织吸水纸吸干。 ⑶入1%氯化金水溶液20~30min，吸干。 ⑷置强光或100W反光灯下照射直到变成棕色。 ⑸于暗处还原于25%蚁酸12~36h，镜检控制。 ⑹入纯甘油软化24h或更长，组织保存于甘油中，用时用甘油封片。 ⑺还原可改用极稀的醋酸水（每100ml蒸馏水加冰醋酸4~5滴）处理。 Ranvier改变法 运动终板等结构可用Cajal及Bieschowsky-Gros等镀银切片法显示，但经氯化金压片法则显示很完整。 方法： ⑴运动终板或肌梭、腱梭均可取材于小白鼠肋间肌或腓肠肌，环层小体取材于幼猫肠系膜，肌肉勿厚过3mm小块。 ⑵组织固定于20%蚁酸（甲酸）约25min至半透明。传统方法用柠檬汁固定10~60min，因柠檬受地区和季节影响不易普及，改用蚁酸。蚁酸制成的标本，肌肉色调偏蓝，很不美观且与神经纤维不易辨别，尤其是固定，镀金稍过度的组织更是如此，一般不理想。 改用下液固定至组织呈半透明，效果满意。肌组织及一直在层小体呈红紫色，神经纤维黑色。 柠檬酸10~20g，葡萄糖5~7g，1%氯化金水溶液0.5~1ml，蒸馏水100ml ⑶用干净滤纸将固定的组织沾干。 ⑷1%氯化金水溶液暗处浸15~60min至肌组织呈金黄色。如变成棕色，浸染过度，应减少作用时间。 ⑸直接投入25%蚁酸过夜（8~12h）或20%蚁酸1天（均在暗箱内）。如组织在一定时间内已呈红紫色，神经纤维成黑色，表示还原完成，效果良好；如组织呈紫色，则为过度，蓝色为很过度，应弃去不用。 ⑹蒸馏水换洗若干次，用滤纸将组织沾干。 ⑺浸入下液备检，可放较长时间。 甘油（中性CP）10ml，50%酒精10ml ⑻取出组织，放在载玻片上，滴加少量纯甘油，用针轻拨组织，加盖玻片并轻压。镜检如可用，用树胶加盖玻片封固。 结果：肌肉、环层小体、肌梭、腱梭红紫色，神经纤维黑色。 注：镀金后，将组织浸于1：500醋酸水溶液内，放强阳光下曝晒若干小时，也可达到还原目的。加盖玻片时勿过分用力，以㤃神经末梢与神经纤维断碎。 ⑴取小鼠上唇小块组织固定于吡啶与蒸馏水等量混合液2天，充分水洗1天，除去吡啶。 ⑵将组织浸入大量无水酒精2天，用滤纸沾干。 ⑶37℃温箱避光镀银（1%硝酸銀）5天，水急洗。 ⑷还原1天，水洗。 还原液：蒸馏水40ml，40%甲醛液10ml，焦性没食子酸1g ⑸脱水，透明，石蜡包埋，切片。 结果：神经纤维黑色，其它组织黄色。 动物以年幼较好。 De Castro内耳双极神经元显示法 方法： ⑴取幼年豚鼠内耳，剔除外表软组织，在下液固定兼脱钙1、~5天，以针刺入骨即可，流水冲洗1天。 水合氯醛5g，95%酒精50ml，蒸馏水50ml，浓硝酸3~5ml ⑵在0.5%的95%酒精氨液浸24h，用滤纸沾干组织外液体。 ⑶1.5%硝酸銀水溶液37℃避光浸7天，每隔2天换新銀液. ⑷还原2天，水洗。 还原液：焦性没食子酸1.5g，甲醛8ml，蒸馏水100ml。 对苯二酚可代替焦性没食子酸，但着色可能不均匀。 ⑸脱水，透明，石蜡包埋，切片12~15㎛。 结果：骨组织黄色，神经元突起及神经纤维黑色。 镀银还原后，投入70%酒精有助于洗净组织镀银的黄色调。 方法： ⑴组织固定于下液3~4天，脱水，透明，石蜡包埋，切片10~20㎛。 固定液：37%甲醛液5ml，冰醋酸5ml，80%酒精90ml ⑵切片烘干，经（二）甲苯脱蜡下行入水。 ⑶切片在1%铬酸水溶液10~30min（37℃），蒸馏水洗15min（随洗随换）。有助于改善染色与背景的对比度（用1%重铬酸钾或5%甲醛的pH7.4，0.1M磷酸缓冲液均各2h/37℃处理亦行）。 ⑷镀银16~24h（37℃避光），蒸馏水急洗。 0.01%硝酸銀的0.1M硼酸/硼砂缓冲液，pH8. ⑸在0.5%醋酸水溶液洗20min换两次。 ⑹入还原液还原5~10min至切片呈灰褐色。再在0.5%醋酸水溶液5min终止还原。 还原液：A液，无水碳酸钠50g，蒸馏水1000ml B液：硝酸铵2g，硝酸銀2g。无水矽钨酸（Tungstosilicic acid）10g，蒸馏水1000ml C液：37%甲醛液7ml，B液1000ml 先将B液7ml慢慢加入A液10ml内，随加随猛烈摇荡，再慢慢加入C液3ml（加时必须按下述次序，猛烈摇荡，否则制成白色沉淀）。 ⑺用1%氯化金水溶液调色。 ⑻脱水，透明，封片。 结果：神经纤维黑色。 H.F.Glassner心脏神经纤维镀银法（1954） 此法浸染良好时，网状组织不着色，神经纤维呈褐色至黑色。 ⑴取狗心脏切为2.5mm厚（有内膜和外膜）固定于下液48h。 固定液：70%酒精100ml，水合氯醛5g 最好麻醉后先从心脏冠状动脉注射1000ml固定液，再切成小块固定。 ⑵入含0.3%氨水的95%酒精4h。 ⑶95%酒精洗多次，无水酒精脱水，透明，石蜡包埋。 ⑷切片12~15㎛，粘片。 ⑸切片脱蜡入水。 ⑹入1%蛋白銀200ml加銅丝10g于38℃浸48h，蒸馏水冼3次共2min。 ⑺入含1%对苯二酚及5%硫化钠水溶液还原5min。 ⑻自来水和蒸馏水各洗5min换多次。 ⑼入0.25%氯化金水溶液3~5min，蒸馏水洗10s。 ⑽1%草酸水溶液脱色10s，蒸馏水洗。 ⑾5%硫代硫酸钠水溶液固定，自来水洗。 ⑿脱水，透明，封固。 Cajal改良Golgi视网膜神经元铬銀法 ⑴取新鲜眼球的视网膜一块浸入下液1~2天，滤纸吸干。 3%重铬酸钾水溶液20ml，1%锇酸水溶液6ml ⑵入0.75%硝酸銀水溶液24h。 ⑶不经水洗，直接入下液24~36h，滤纸吸干。 3%重铬酸钾10份，1%锇酸水溶液1份 ⑷入0.75%硝酸銀水溶液24h。 ⑸40%酒精1~2h，换多次，转入无水酒精脱水，Golgi火棉胶法包埋。 肌间神经丛分布于肌层与内环肌与外肌之间，由数个神经元和无髓神经纤维组成。可用铅盐镀染神经组织和Gros-Bielschowsky法。 ⑴组织块在丙酮或中性福尔马林固定1~4天，冰冻切片或组织块镀染（以小肠上纵肌层为好）。一般认为此法腫显示猫肠壁肌间神经丛的Dogiel Ⅰ、Ⅱ型细胞有显著效果。 ⑵经固定的组织或切片以蒸馏水洗。 ⑶入孵育液37℃恒温箱内染5~6天。 孵育液：醋酸盐缓冲液（pH4.7~5.0）10ml，3%醋酸铅水溶液10ml，蒸馏水80ml 醋酸盐缓冲液：13.6%醋酸钠水溶液100ml，6%醋酸水溶液50ml 基于神经成分中正磷酸盐含量差别，可将染色天数改变。 ⑷用蒸馏水洗多次，共15~20min。 ⑸入0.1~0.5%亚硫酸钠、硫化钠、硫化铵水溶液1min，切片立即变成黑色。 ⑹脱水，透明，封片。 若在硝酸铅水溶液中加入有机磷化物，能缩短浸润时间，而且各种细胞更清晰。 切片在入硝酸铅前加温（5min内达到60℃）或以5~10%赤血盐水溶液处理12~20min，切片入下液6~8h。 在孵育液中少用蒸馏水10ml加入20%甘油磷酸钠水溶液10ml 蒸馏水洗几次。浸入0.1~0.5%硫化钠、硫化铵水溶液，神经组织迅速变黑，脱水，透明，封片。 此法能显示各型细胞，例如猫肠肌肌间神经丛的神经节细胞，同时能显示Dogiel Ⅰ、Ⅱ型细胞。 方法： ⑴取猫、兔小肠一小段（猫小肠较好），先用注射器注入生理盐水洗净肠腔。 ⑵用缝纫线结扎肠一端，注入60%酒精9份、甲醛1份的固定液充满肠腔，再结扎另一端，放入固定液固定3~15天。 ⑶流水冲洗24h，转入蒸馏水24h，换几次蒸馏水。 ⑷剪开肠管，将黏膜层和环行肌层除去，仅留下纵行肌，侵害成小块。 ⑸置于20%硝酸銀水溶液 15min左右（37℃），蒸馏水 速洗。 ⑹入对苯二酚还原液处理5~10min（37℃），蒸馏水洗。 对苯二酚1.5g，甲醛3ml，蒸馏水100ml ⑺入下液直到变成黑色，流水冲洗10min或更长。 硫氰化铵1.5g，蒸馏水50ml，1%氯化金水溶液1ml 先将硫氰化铵溶于蒸馏水，再加氯化金水溶液。视颜色深浅，调整氯化金的量。 ⑻常规脱水，用滤纸或吸水纸将组织压平，透明，封片。 结果：神经元与神经纤维蓝黑色。 如经硫氰化铵、水洗后取出镜检染色模糊，用2%硫代硫酸钠水溶液50ml、10%铁氰化钾水溶液4ml分色至背景浅蓝紫色为止，再流水冲洗。 ⑴取材：一般以小肠为好，猫小肠更满意。取小肠一段，于小肠腔内放入玻璃棒，用小刀纵行划开。将黏膜及环行肌去掉，所剩的纵行肌为所需材料。 ⑵固定：1~4℃固定冷丙酮1~2h。 ⑶将纵行肌从固定液取出，蒸馏水洗。 ⑷入70~60℃蒸馏水5min（5min内温度下降10℃），蒸馏水洗1~2min。 ⑸入酶作用液2~6h，蒸馏水洗。 缓冲液：冰醋酸12ml，蒸馏水300ml；醋酸钠39.9g，蒸馏水200ml。等量混合。pH4.7~4.8。 作用液：甘油磷酸钠0.14g，蒸馏水20~30ml，缓冲液12ml，加蒸馏水至90ml，再加3.3%硝酸铅水溶液10ml ⑹转入0.1~0.5%硫化铵或硫化钠水溶液，组织立即变黑，蒸馏水洗。 ⑺吸干，脱水，透明，封片。 眼球肌或肋间肌Lowit蚁酸法 取小块新鲜眼球肌或肋间肌勿超过1mm，入用蒸馏水稀释1~2倍的蚁酸溶液至组织透明约10~20min。移至1%氯化金水溶液15`20min至组织呈黄色（Grabower用0.25%氯化金水溶液）。将组织移入上述染液暗处24h，再入纯蚁酸数小时至组织局部呈紫色，周围暗褐色，蒸馏水洗。取其小块入在载玻片上，加盖玻片（稍加压力）检查，浸染好的神经呈棕黑色。制成分离或切片标本。浸染好的是组织中央部分。此法对运动终板和触觉小体最佳。 附：电镜标本制作固定液 5%戊二醛磷酸盐缓冲液： 0.2M磷酸盐缓冲液50ml，25%戊二醛水溶液10ml，双蒸水40ml。pH7.4.固定1~2h。如用1~1.5%戊二醛磷酸缓冲液固定液固定血液、骨髓、肝脏和小肠等，反差和膜结构保存较好。对一些致密难浸的组织，戊二醛浓度可达4~6%。 经戊二醛磷酸缓冲液固定的标本，须经0.1M磷酸缓冲液冲洗3~12h，换几次液。 0.2M磷酸缓冲液配制 A液：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）1.56g，双蒸水加至50ml B液：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）7.16g，双蒸水加至100ml 取A液19ml加B液81ml，调至pH7.4。 5%戊二醛二甲砷酸钠缓冲液固定液：0.2M二甲砷酸钠缓冲液75ml，25%戊二醛水溶液25ml。pH7.2`7.4。固定1~2h，用0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗3~12h，多次换液。 0.2M二砷酸钠缓冲液： A液：二甲砷酸钠4.28g，双蒸水75ml B液：0.1N盐酸10ml A液溶解后加B液5.5`6ml，pH调至7.4。 多聚甲醛-戊二醛混合固定液：多聚甲醛2g，双蒸水25ml，加热至60~70℃，使多聚甲醛溶解成乳状，加入1N氢氧化钠2~3滴使其透明，用水冷却后，依次加入：0.2M二甲砷酸钠缓冲液15ml，25%戊二醛水溶液10ml，无水氯化钙0.025g。 此液含4%多聚甲醛、5%戊二醛，弥补了使用戊二醛固定不充分的缺点，且渗透较快。可用于电镜组化方法的前固定。固定1~2h后，用0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗3~12h。如用磷酸盐缓冲液可不加氯化钙。 此液浓度较高。可用0.1M二甲砷酸钠缓冲液与固定液等量混合，成为2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液。后液特别适用于灌注固定法。如用0.2M磷酸盐缓冲液代替0.2M二甲砷酸钠缓冲液，效果亦佳。 灌注固定法： 能快速固定组织，很好地保存组织的微细结构，特别适于切块困难的难以置信组织和难以渗透、死后变化快的组织和器官。灌注液多用戊二醛或戊二醛-多聚甲醛混合液，灌注部位依器官而定。 1.按实验动物体重注射麻醉剂，同时注射防止凝血（每10单位可抗凝100ml血液）。 2.20min后腹腔注射50%（W/V）尿素水溶液，1.5ml/kg体重。 3.10min后腹腔注射10%亚硝酸钠生理盐水作为血管扩张剂。大动物如猴注射2ml，大白鼠等小动物注射0.5ml。 4.将动物固定在解剖台上，剖露灌注的动脉，切断 对应的静脉。如从心脏灌注则切开右心房，大左心室把玻璃插管插至主动脉处，用细线结扎，防止脱落。 5.利用吊瓶高度调节注入压。常用与动物血压略等的压力灌注。如大白鼠平均血压100~120mmHg，吊瓶高度以100~150cm为宜。灌注37℃的生理盐水至流出液体不见血色为止。 6.注入4℃固定液。注入量大约为300ml/kg体重。尚可根据所取部位和固定的硬度而定。灌注速度约5~10ml/min。先快后慢。 7.灌注后取出所需组织，切块后再固定1~2h。 此法较复杂，适用于较大动物。对一般小的动物，在麻醉后用100ml注射器连接点滴用的头皮针(针头尖部焊一小隆起，以便固定结线用)，从颈动脉（取头部材料）或腹主动脉（取胸腹材料），或从左心室插入，结线固定后剪开对应静脉或右心房，先注入37℃生理盐水至流出液无血色为止。然后推入固定液。注入量与速度同前。 固定后的冲洗： 组织经醛类固定液固定后，必须将组织内的醛完全洗去，否则将减弱锇酸的固定作用。冲洗液一般用配制固定液的同系列缓冲液。为维持等渗，可在缓冲液加等渗量的蔗糖或其它盐类。冲洗时间一般3h以上，并需多次换液。缓冲液可作为保存液，将经醛类固定的组织块停留缓冲液在4℃保存数周无妨。 经锇酸固定的组织，可作短时双蒸水冲洗或不冲洗而直接脱水。脱水时用铀盐块染，须有稍长时间的冲洗（30min以上），除去多余的锇酸，避免出现沉淀影响铀染色。 本书涉及的化学试剂
附:Schiff试剂 配制 煮沸蒸馏水200ml，停火后加入碱性品红1g，存储搅拌使之溶解。 待溶解冷至50℃，加入1N盐酸20ml，冷至室温（25℃）时加偏重亚硫酸钾或钠1g，摇荡，置暗处过夜。 又加活性碳2g（不要过期的）充分摇荡数分钟，过滤。滤液呈无色或淡黄色，盛入有色䕏内，保存于4℃冰箱。 1N盐酸：浓盐酸82.5ml加蒸馏水至1000ml。 |
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