 [0001] 本发明涉及植物组织灭菌的技术领域，具体涉及一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法。 背景技术： [0002] 由于取自外界的植物组织培养所用的外植体表面及植物组织内部都带有微生物，如果这些微生物不彻底灭除，一旦带入培养基，会造成培养基污染，特别是植物组织内部存在的病菌更是难以消除，是主要的污染源。 [0003] 对于植物组织内部携带真菌和细菌已有相关研究证实，张建春等人对香蕉组织进行内生真菌分离、鉴定，共分离到9属494株内生真菌；周俊辉等也报道称很多植物组织内部存在内生细菌，且在植物组织培养中，由于材料内部(细胞内或细胞间)的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，引起内生细菌污染，其危害性极大。 [0004] 在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼察觉，如不仔细观察很易被忽视(背光检查时较易被发现)，随着继代培养次数的增加，菌量逐渐累积，才在培养基上显现出来，导致培养失败。 [0005] 同样在胡士敬等人的发明中，虽然清洗与灭菌工作同步开展，避免了自来水中或是外植体上冲洗下来的微生物沿着外植体的毛细管进入植物气管内部，在一定程度上也降低植物组织培养的污染率，但这种方法只是最大限度的降低了外植体消毒过程中外界病菌的入侵，组织内部的内生菌却并未除去，外植体在培养的过程中仍有较大的污染率。 [0006] 目前已有可用于植物外植体消毒的灭菌消毒剂有酒精、升汞、次氯酸钠、漂白粉、过氧化氢、新洁尔灭等。 [0007] 其中酒精是最常用的表面消毒剂，以70-75％酒精杀菌效果最好，因为95％或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低；另外酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好，同时它还有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入；但酒精对植物材料杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间；而且酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。 [0008] 氯化汞也是植物外植体表面灭菌最为常用的灭菌剂；它是一种无机汞剂，抑制细菌巯基酶活性，使细菌代谢发生障碍，汞离子可与菌体蛋白结合，使蛋白变性，从而杀死菌体，杀菌力极强，效力比酚大，但对芽孢、病毒无效；也是一种剧毒化合物，对植物组织有一定的毒害作用，无法长时间处理进行植物组织内部消毒，且在室温下具有轻微挥发性，有可能导致实验室工作人员发生汞中毒。 [0009] 因此寻找一种替代氯化汞进行植物外植体表面消毒的灭菌剂，减少汞的使用量，对安全使用和环境保护具有重要意义。 [0010] 次氯酸钠可释放出活性氯离子杀死菌体；其消毒能力很强，不宜残留，对环境无 害；但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。 [0011] 漂白粉的有效成分是次氯酸钙，消毒效果很好，对环境无害，但它易吸潮散失有效氯而失效。 [0012] 过氧化氢消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，只能用于叶片的消毒，不能渗透到组织内部杀菌。 [0013] 新洁尔灭，别名苯扎溴铵，是一种表面活性消毒剂，表面活性剂改变细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起到杀菌作用；对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好，但对绿脓杆菌、抗酸杆菌和细菌芽孢无效。 [0014] 综上对几种消毒剂优缺点进行对比，发现没有一种消毒剂是既可以渗入组织内部杀菌又对植物组织伤害较小的，因此对于寻找一种可灭除植物外植体表面微生物和内生菌的安全低毒且性价比高的灭菌剂意义非凡。 技术实现要素： [0015] 本发明的目的在于：针对目前没有一种消毒剂是即可以渗入组织内部杀菌又对植物组织伤害较小的问题，提供了一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法，解决了即可以渗入组织内部杀菌又对植物组织伤害较小的问题。 [0016] 本发明的技术方案如下： [0017] 一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法，包括以下步骤： [0018] 步骤1：将采来的外植体除去不用的部分后，进行清洗处理； [0019] 步骤2：在超净工作台上操作，用浓度为70-75％酒精溶液将外植体浸泡10-30s，进行初步灭菌； [0020] 步骤3：使用氯溴异氰尿酸+多菌灵组成的消毒剂对外植体进行二次灭菌； [0021] 步骤4：使用无菌水对外植体进行清洗。 [0022] 进一步地，所述步骤1中的清洗处理包括：用洗洁精清洗干净后，再用大量的自来水冲洗30min。 [0023] 进一步地，所述步骤3中的氯溴异氰尿酸的浓度为3g/l；多菌灵的浓度为1g/l。 [0024] 进一步地，所述步骤3中的二次灭菌时不断晃动，使植物材料与消毒剂充分接触。 [0025] 进一步地，所述步骤4中清洗的次数为3-5次。 [0026] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是： [0027] 1.一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法，采用氯溴异氰尿酸+多菌灵组成的消毒剂对外植体进行二次灭菌，氯溴异氰尿酸与多菌灵混配，对真菌、细菌的灭菌效果与传统的hgcl2灭菌效果相当，完全可以取代hgcl2对植物外植体进行灭菌消毒；同时氯溴异氰尿酸作为一种高效、广谱和新型内吸性杀菌剂，其化学性质稳定，便于贮存运输，具有使用安全、简便、用量少以及对外植体表面和内部均杀菌效果良好等特点，其溶液能在作物表面能缓慢释放次溴酸(hobr)和次氯酸(hocl)，可杀灭各种细菌、藻类、真菌和病毒，具有保护、治疗、铲除以及营养四重独特功效，内吸性强，通过内吸传导作用，释放次溴酸，形成三嗪二酮(dht) 和三嗪(adht)，具有强烈的杀灭组织内部细菌、真菌、病毒的作用，无交互抗性，对作物安全，环保无公害，是发展绿色农业的首选杀菌剂。而多菌灵作为一种具有内吸治疗和保护作用的高效低毒内吸性杀菌剂，与氯溴异氰尿酸混配来取代hgcl2，进行植物外植体消 毒，既有良好的灭菌效果，又低毒环保。 [0028] 具体实施案例 [0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。 [0030] 一种植物外植体安全低毒高效灭菌的方法，包括以下步骤： [0031] 步骤1：将采来的外植体除去不用的部分后，进行清洗处理； [0032] 步骤2：在超净工作台上操作，用浓度为70-75％酒精溶液将洗净后的外植体浸泡10-30s，进行初步灭菌； [0033] 步骤3：使用氯溴异氰尿酸+多菌灵组成的消毒剂对初步灭菌后外植体进行二次灭菌； [0034] 步骤4：使用无菌水对二次灭菌后的外植体进行清洗。 [0035] 所述步骤1中的清洗处理包括：用洗洁精清洗干净后，再用大量的自来水冲洗30min。 [0036] 所述步骤3中的氯溴异氰尿酸的浓度为3g/l；多菌灵的浓度为1g/l。 [0037] 所述步骤3中的二次灭菌时不断晃动，使植物材料与消毒剂充分接触。 [0038] 所述步骤4中清洗的次数为3-5次。 [0039] 首先将采来的“兰州百合鳞片”和“马铃薯茎段”除去不用的部分后，进行清洗处理；然后在超净工作台上操作，用浓度为70-75％酒精溶液将外植体浸泡10-30s，进行初步灭菌。 [0040] 选用氯溴异氰尿酸和clo2，设置不同的浓度梯度和时间梯度，对“兰州百合鳞片”和“马铃薯茎段”进行二次灭菌，分别与浓度为1.0g/l hgcl2(处理10min)进行对比，确定氯溴异氰尿酸和clo2对植物外植体的灭菌效果。 [0041] 氯溴异氰尿酸和clo2分别设置了5个浓度梯度和5个时间梯度，即氯溴异氰尿酸在浓度为1、2、3、4、5g/l的条件下分别处理4、6、8、10、12h，共25个处理组合；clo2(秀霸) 在浓度100、200、300、400、500mg/l的条件下分别处理1、2、3、4、5h，共25个处理组合。 [0042] 其实验数据如下： [0043] 表1-1氯溴异氰尿酸处理和clo2处理“百合鳞片”细菌污染率统计(％) [0044][0045] 表1-2氯溴异氰尿酸处理和clo2处理“马铃薯茎段”细菌污染率统计(％) [0046][0047] 表2-1氯溴异氰尿酸处理和clo2处理“百合鳞片”真菌污染率统计(％) [0048][0049] 表2-2氯溴异氰尿酸处理和clo2处理“马铃薯茎段”真菌污染率统计(％) [0050][0051][0052] 表3-1hgcl2处理“百合鳞片”真菌污染率和细菌污染率统计 [0053] 处理时间(min)hgcl2(g/l)真菌污染率(％)细菌污染率(％)10116.30.34 [0054] 表3-2hgcl2处理“马铃薯茎段”真菌污染率和细菌污染率统计 [0055] 处理时间(min)hgcl2(g/l)真菌污染率(％)细菌污染率(％)10110.40.17 [0056] 结果表明氯溴异氰尿酸和clo2对细菌和真菌的消除效果均随浓度的增大和时间的延长而越好。 [0057] 从表1-1至3-2中，氯溴异氰尿酸、clo2及hgcl2对兰州百合鳞片和马铃薯茎段的灭菌效果相互对比，发现氯溴异氰尿酸的消毒效果明显较clo2好，且氯溴异氰尿酸在处理浓度为 3g/l、处理时间为8h时，其灭菌效果较hgcl2更好；但仍有部分内生真菌没有消除，在培养过程中，会陆续出现少量真菌污染。 [0058] 因此又选用了针对真菌的灭菌剂与氯溴异氰尿酸复配进行试验。 [0059] 即组合1：氯溴异氰尿酸(3g/l)+多菌灵(1、1.5g/l)+吐温-20(500μl/l)处理8h。 [0060] 组合2：氯溴异氰尿酸(3g/l)+甲基托布津(1.0、1.5g/l)+吐温-20(500μl/l)处理8h。 [0061] 表4-1氯溴异氰尿酸与多菌灵、甲基托布津混配后处理“百合鳞片”真菌污染率与 细菌污染率比较 [0062][0063][0064] 表4-2氯溴异氰尿酸与多菌灵、甲基托布津混配后处理“马铃薯茎段”真菌污染率与细菌污染率比较 [0065][0066] 表4-1和4-2中，两个组合相互对比，筛选出对内生真菌灭菌效果最好的组合。 [0067] 通过试验验证，组合1多菌灵浓度为1g/l和1.5g/l时，灭菌效果均较好，而本着药剂低量高效安全使用原则，最终确定多菌灵浓度为1g/l；组合2甲基托布津浓度为1.5g/l时处理效果较好，但与组合1相比，其真菌污染率仍偏高。因此氯溴异氰尿酸(3g/l)+多菌灵 (1g/l)的消毒剂对内生真菌灭菌效果最好。 |
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