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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号,2022年2月19日
*编辑:俞纪元
近年来,免疫治疗在对抗癌症转移和复发方面取得了重大的突破。如免疫检查点阻断策略、过继性T细胞治疗策略和肿瘤疫苗等均已取得显著的临床成果。但是,由于肿瘤微环境(TME)固有的免疫抑制作用,只有一小部分患者可以对免疫治疗产生反应。因此,逆转TME的免疫抑制性对提高实体瘤的免疫治疗敏感性至关重要。研究表明,具有活性氧(ROS)生成能力的纳米材料表现出显著的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)调节功能,可将促肿瘤的M2型TAM极化为抗肿瘤M1型。
鉴于此,山东大学李春霞教授联合中科院长春应化所林君研究员和广州医科大学侯智尧教授设计了一种TME响应的智能纳米酶体系UCNPs@Cu-Cys-GOx(UCCG)。该复合材料采用铜氨基酸纳米酶(Cu-Cys)包覆稀土上转换纳米粒子(UCNPs)构筑纳米载体,并在其表面共价连接葡萄糖氧化酶(GOx)。该集成化纳米酶结合了天然酶和纳米酶的优势,可通过酶级联反应增强肿瘤部位活性氧(ROS)的产生,进而实现对肿瘤的多模式治疗(饥饿治疗/化学动力学(CDT)治疗/免疫治疗)。具体而言,在肿瘤微环境下该纳米酶中Cu-Cys与谷胱甘肽(GSH)反应生成Cu+和氧化型谷胱甘肽(GSSG),GSH的消耗不仅减少了对ROS的清除,而且由GSH消耗引发的大量ROS积累还会导致“铁死亡”的发生。此外,该纳米酶释放出的GOx能催化肿瘤细胞内的葡萄糖和O2反应生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2),一方面可实现肿瘤饥饿治疗,另一方面,生成的H2O2与芬顿试剂Cu+反应产生细胞毒性的羟基自由基(·OH)。这些增强的氧化应激可以逆转免疫抑制的TME,促进巨噬细胞M1向M2转变,增强肿瘤的免疫反应。进一步结合anti-PD-L1抗体可触发该纳米酶的多模式协同治疗效应,可有效抑制了原发肿瘤的生长和转移。此外,该复合纳米酶在正常组织中保持惰性,只有在TME中才被特异性激活,并且UCCG在TME中会呈现上转换荧光增强现象,可用于活体成像和实时检测ROS的生成。
图1. UCCG的合成路线与TME激活的酶级联催化反应协同癌症饥饿治疗/CDT/免疫治疗示意图。
结果和讨论
01
UCCG的合成和表征
首先利用热分解的方法合成油酸稳定的上转换纳米粒子β-NaYF4:20%Yb、2%Er@NaYF4@NaYF4:40%Yb、以及0.5%Tm@NaYF4。然后,通过配体交换方法用L-Cys替换掉油酸,进一步利用铜离子与L-Cys的配位作用在上转换纳米粒子的表面包覆铜氨基酸复合物。从透射电镜可以清楚地看到上转换纳米粒子表面均匀的Cu-Cys层。而UCNP@Cu-Cys(UCC)中的 Er、Tm、Cu 和 S 元素的映射图也进一步揭示了其组成和核壳结构的成功合成。XRD的测试结果也同样表明Cu-Cys涂层的形成。随后,利用巯基和铜的配位作用,将SH-PEG-NH2连在其表面,这样一方面可以增强生物相容性,另一方面可以用来共价连接葡萄糖氧化酶(GOx)。
图2. UCCG的合成与表征。
(a)β-NaYF4:20%Yb,2%Er,
(b)β-NaYF4:20%Yb,2%Er@NaYF4@NaYF4:40%Yb,0.5%Tm@NaYF4,和(c)UCC的透射电子显微镜图像。
(d-h)高角度环形暗场扫描透射电子显微镜和元素映射图。
(i)X射线粉末衍射图。
(j)UCC的XPS图。
02
UCCG增强ROS产生的能力
UCCG能够模拟谷胱甘肽氧化酶(GSHOx)的活性,不仅可以消耗GSH,还会将二价铜离子转换为一价铜离子用于增强芬顿反应。另外,UCCG表面共价连接的GOx还会与葡萄糖反应产生葡萄糖酸和H2O2,通过提高了H2O2的含量增强了芬顿反应的效率和ROS产生的能力。
图3. (a)UCCG的GSH消耗能力。
(b)不同浓度的GSH处理UCCG后的荧光光谱图。UCCG与GSH反应前(c)和后(d)的Cu 2p XPS图。
(e)不同纳米催化剂的POD活性分析。
(f)GSH处理前后纳米催化剂的POD酶活性测定。
(g)TA,UCCG和H2O2一起孵育后的荧光光谱图。
(h)TA,UCCG和葡萄糖 (10 × 10−3 M) 一起孵育后的荧光光谱图。
(i)不同纳米催化剂的ESR图。
03
UCCG的体外细胞毒性研究
UCCG的体外细胞毒性研究首先通过MTT实验进行评估。结果发现肿瘤细胞4T1的细胞存活率会随着UCCG浓度的增加而逐渐下降,这表明UCCG通过与肿瘤细胞中过表达的H2O2和谷胱甘肽反应,发挥其抗肿瘤性能。随后,通过GSH含量试剂盒的检测也表明UCCG可以消耗细胞中的GSH,而GSH的缺失可导致谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)失活,进而导致脂质过氧化(LPO)从而诱导铁死亡。因此,具有类GOx、GSHOx和POD活性的UCCG可协同饥饿治疗、CDT和铁死亡等方式来高效杀伤癌细胞。
图 4. UCCG的体外细胞毒性。
(a)癌细胞和正常细胞经过UCCG处理后的相对细胞存活率。
(b)4T1细胞用不同浓度的UCCG处理后GSH的含量。
(c)使用不同浓度UCCG处理的4T1细胞中GPX4含量(对照:PBS,25:25 μg mL-1 UCCG,50:50 μg mL-1 UCCG)。
(d)在不同时间段肿瘤内注射UCCG的荷瘤小鼠的UCL图像。
(e)UCL在不同时间的总信号强度。
(f)在不同样品(PBS 和 UCCG)中使用Liperfluo检测细胞内LPO相对含量。
04
UCCG在体外的免疫调节作用
ROS导致的氧化应激可使巨噬细胞从M2表型转换到M1表型。UCCG治疗组中M1巨噬细胞比例由17.0%增加到27.5%,M2巨噬细胞比例由31.6%下降到17.2%。此外,在UCCG治疗组中,M1巨噬细胞分泌的白细胞介素12(IL-12)与对照组相比升高了5.2倍,而免疫抑制因子白介素10(IL-10,由M2巨噬细胞分泌)下降了4.7倍。以上结果均证明UCCG可以在体外将M2表型重编程为M1巨噬细胞来逆转TME中的免疫抑制性。
图5. UCCG在体外的免疫调节作用。
(a)代表性流式细胞图和M1型巨噬细胞(CD86+)(b)和M2型巨噬细胞(CD206+)(c)的相应量化图。不同处理后上清液中IL-12(d)和IL-10(e)的分泌水平:(1)可控组,(2)UCC,(3)UCCG
05
UCCG在体内的免疫调节作用
研究者进一步在4T1荷瘤小鼠中测量了UCCG对免疫反应的激活作用。与对照组相比,UCCG治疗组中M2巨噬细胞的数量明显减少,而M1巨噬细胞的数量出现上升。这表明UCCG可以有效地逆转TME种的免疫抑制性。同时,UCCG可有效激活树突细胞(DC),CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的表达。这些结果都表明UCCG可以有效地重编程抑制性TME并引发剧烈的免疫反应。
图 6. UCCG 在体内的免疫刺激作用。
(a)不同治疗后肿瘤中M1和M2巨噬细胞的流式细胞比例图。
(b)M2型巨噬细胞(CD206+,F4/80+)和(c)M1型巨噬细胞(CD86+,F4/ 80+)的量化图。
(d)对通过不同治疗的小鼠淋巴结中DC细胞群的流式细胞图和(e)DC细胞的相应量化图。
(f)脾细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞群的流式细胞图和CD4+ CD3+ T细胞(g)和 CD8+ CD3+ T细胞(h)的相应定量图。
06
UCCG的体内抗肿瘤功效
由于UCCG具有优异的酶模拟特性和激活免疫反应的能力,UCCG可有效地抑制原发和远端肿瘤的增长,并且在14天监测范围内小鼠体重变化不大,各器官均无明显损伤。
图 7. (a)协同治疗联合α-PD-L1阻断的双侧肿瘤模型的治疗方案。
(b)不同治疗后的Balb/c小鼠原发肿瘤体积和(c)远端肿瘤的体积。
(d)不同处理后的Balb/c小鼠的存活率。
(e)治疗14天后肿瘤组织的H&E染色图像。比例尺:10 µm。
总结
本研究设计了一种智能多功能的UCCG纳米催化剂,它可以通过逆转TME的免疫抑制性来实现有效的癌症免疫治疗。在肿瘤内,UCCG会与葡萄糖反应以关闭营养源以实现饥饿治疗,并提供H2O2以促进CDT。此外,UCCG中的Cu2+被细胞内的GSH还原生成芬顿试剂Cu+,进而与H2O2反应产生更多的ROS。ROS的生成可以将M2型巨噬细胞转换为M1型巨噬细胞。此外,通过UCNPs的发光强度能够实时监测CDT的过程。体内实验表明,PD-L1抗体与UCCG联合介导的多模式治疗可有效抑制原发和远端肿瘤的生长。
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