【原】空间转录组这么火，何不一起入个门

“一切都与空间有关。空间单细胞转录组学是单细胞分析之后的下一波浪潮，对于研究人类疾病的实验室特别有用，人类疾病通常始于单细胞并在空间上传播。”

            ——卡罗林斯卡学院生物学家 Sten Linnarsson 这么评价《Nature Methods》在2020的年度技术

10X genomics花重金打造10X visium，国内也有许多生物企业如华大、百迈客等极力推广他们的技术。科研的关注重点与资本同时向这一技术倾斜，这就不由让我们提出疑问：

空间转录组真的重要吗？为什么我需要它？

什么是空间转录组？

要回答这个问题，首先你得知道什么是单细胞测序，用一个比喻就是给每个细胞都标上了一个条形码，然后把每个细胞内的RNA都测出来，而空间转录组，简单的来说，就是在这个基础上，给每个细胞的条形码上再加上了位置信息。

但又不完全是给每个细胞加上位置，而是给每个似细胞的区域加上位置信息，即是其可测得的最小单位（bin），或者最小分析单位（spot，由多个bin构成）。空间转录组有好几个分类，自2016年那篇原位的空间转录组文章以来，显微切割再测序，原位捕获等都在进步。由于原位捕获目前在近期有较大的进展——拥有高通量、高捕获面积、高分辨率近似亚细胞的特点，我们这里主要讲这种。

图片来源[蓝林观海]

实验上操作还是相对简单的，提供新鲜组织冰切片即可，切片，上机。这里也不作过多的描述。

为什么要空间转录组？

这个问题其实就是回答为什么位置信息是重要的？为什么只有单细胞不行？

• 深入到在器官或组织之中，你会发现不同类型的细胞分布是极其精细而又美妙的分布的。

  这在发育过程中体现的尤为明显。英国发育生物学家路易斯·沃伯特曾说：“人一生最重要的时刻不是出生、结婚和死亡，而是原肠运动（原肠运动是早期胚胎发育最特殊的阶段）。” 在这时，不同区域信号的相互调控对形成正确的结构至关重要，如Wnt、Bmp等都具有区域性分布特点，以帮助祖细胞在不同区域诱导分化成不同的子代细胞，其中的细胞与细胞的相互调控就很依赖空间信息的辅助。

• 另外，在器官内部，大多数也并非均质的，尤其与代谢功能相关的组织中具有明显的空间单元内部的异质性。

  如肝脏¹、肠道²、胰腺和肾脏等。这些异质性有利于不同功能的分工，如小肠的引窝与绒毛在营养物质和信号通路的分布上不同³ 。增强对这些生命系统空间异质性的理解，特别是在稳态、发育或损伤再生下区域性事件发生过程的理解，对于预防和治疗相关的临床疾病是至关重要的。

  

  而要全面而精细地理解组织内的空间异质性，空间信息的获取是十分必要的。以往的技术存在各自的劣势：普通的染色及FISH技术虽然能够给予空间信息，但其可描述的基因通量相对较低；单细胞测序对于组织内细胞的异质性有着很好的区分作用，但其丢失了重要的空间信息。最近兴起的空间转录组技术既可以很好地表征不同细胞的基因表达谱，同时也保留了对应的空间信息，有着提供详细分子图谱的巨大潜力，是研究空间异质性有力的工具⁴。

空间转录组能得到什么？

具体来说，空间转录组的优势适于研究以下几个方面的科学问题。

• 同类组织内部不同区域的功能特点及细胞分布的异质性描述。

  在稳态下，Sun等发现，ZNRF3/RNF43平衡AXIN2+肝细胞中的Wnt信号，在保持代谢分区的同时抑制肝脏的异常增殖⁶。
  

  Parigi等使用空间转录组描述了小鼠结肠中在稳态和损伤修复时新的结肠区域性特点，并对淋巴滤泡、B 细胞和肠神经系统相关的区域性分布特征进行了鉴定；进一步发现在黏膜愈合过程中，远端结肠的分子特征变化最显著，并发现 p53 的弱活化可定义增殖的上皮干细胞区域⁷。
  

• 同类细胞或者信号通路在不同器官中的异质性描述。

  Chen等利用Stereo-seq空间转录组技术分析获得了小鼠器官发生的图谱，在解析不同器官在发育疾病的易感性差异时，他们发现，对于Wnt5a的表达，上颌骨主要集中在间充质细胞和成纤维细胞上，而四肢主要集中在间充质细胞上。这一结果表明，由WNT5A 突变引起的 Robinow 综合征在这两种组织的发病机制可能不同⁸。

• 微环境中细胞与细胞相互作用的捕获。

  Gao等利用空间转录组定义了小鼠造血干细胞的微环境，并鉴定出巨噬细胞最显著地富集在造血干细胞的微环境中，寻找并鉴定了巨噬细胞分泌的、对造血干细胞增殖有帮助的生长因子，如MDK、 PTN⁹。

  Guilliams等利用多组学技术识别出了一群独特的、脂质相关的巨噬细胞类型，其特异在胆管周围分布，并通过在微环境中寻找相互作用，鉴定出了进化上保守的BMP9/10-ALK1轴，其对巨噬细胞的发育是至关重要的¹⁰。
  

分析策略

上面提到空间转录组最最重要的就是它有能力对空间异质性进行全面的描述，那么如何解析各类的空间异质性，便是分析的重点。

单细胞分析基本知识

• 数据分析对象：本质上是seruat对象，需要加强学习，可以参考这篇，里边包括如何获取各个结构里的数据：

seruat对象学习(https://www.jianshu.com/p/1422461cb84c)

但有所不同的是，空间转录组可能会包含images息，方便在读取片子的时候调用。

数据质量控制

拿到任何数据，分析前第一件事，是要确认数据质量是否ok。

• mapping比对率、reads数
• 整合不同片子的方法，或者说是去batch的方法，方法有很多，Seurat里的integration看起来是效果比较好的。
• 重复性鉴定，一般一个条件得有两个以上重复吧。
• 已知信息验证，连续切片验证空间信息捕获的正确性。
  

从这里开始，你可以对一些工具的基本情况进行学习了，

• Analysis, visualization, and integration of spatial datasets with Seurat(https:///seurat/articles/spatial_vignette.html)
• Advances in spatial transcriptomic data analysis（Genome Res. 2021）(https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC8494229/)
• Clinical and translational values of spatial transcriptomics（Signal Transduct Target Ther.2022）(https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC8972902/)

第一篇是官方空间教学文档进行学习了，这部分不多讲，不熟悉的可以翻看一些基础命令，特别注意里面的标准化的方法，如SCTransform、log-normalization等，选用哪种需要自己判断了。第二篇从空间组技术本身再讲到分析的方法。第三篇里边讲的更多了，还包括了各自分析工具以及在空间组在各类生物学现象中的应用，推荐大家学习。

获取细胞位置信息

在确认数据质量过后，可以获取不同类bin的位置信息了，本质上是对空间里的bin进行分类。

空间里对bin分类的方法大致有以下几种：

• 连续切片对应到空间组的数据上
  这种方法较易让人信服，但因相邻切片存在一定的厚度，对于较小的区域或者几个细胞，这种方法就不适合对应了。
• 自动聚类
  FindClusters +  SpatialDimPlot
• 单细胞映射
  瞿昆团队测试过12种工具，其中预测细胞分布效果最好是RCTD等，另外也有一些基于机器学习的如tangram等可以试试。

  Nature Methods | 空间转录组与单细胞转录组整合分析工具性能测试(https://zhuanlan.zhihu.com/p/521011013)

获取区域性表达信息

• 定义的区域间比较
• 基因、基因集打分
  这个与单细胞分析很像，输入基因集作为一个module判断哪个群体里的module分数最高，常用的方法有Gsea, Gsva, Seurat包中的AddModuleScore函数等。注意，ModuleScore在计算的打分的时候会受数值的大小的影响，如果你输入的基因的值都很低，那么你算出来的值也会低，并且波动很大，较不准确。

• 与单细胞测序或者Fish等染色结合
  对于分辨率不够而又想获取空间的单细胞的信息，结合配套的单细胞数据分析往往提供更准确的信息。而Fish结合特定类型的染色也能得到哪类细胞表达了哪些基因。

Cell-cell interaction分析方法

• 单细胞分析+空间验证
  如上面提到的巨噬细胞对造血干细胞增殖影响的分析那样。
• hotspot
  通过hotspot这个工具，可以将组织进行特定区域进行分类，并做出相应的基因富集，进一步可对分类找到特定的区域内部进行微环境的分析。

• 带位置信息的空间 cell-cell interraction 分析
  如这篇斑马鱼发育的文章，直接在空间转录组上找互作，认为在5个bin内有互作的才算是真正的互作，提高了得到的ligand-receptor pairs的可靠性。
  注意有时ligand与receptor表达量不均匀，需要对基因作Magic插值处理。

其它

Mfuzz、monocle、scenic……基本上单细胞分析中工具都可以用（空间组本质上就是个对象）

参考

1. Hoehme, S. et al. Prediction and validation of cell alignment along microvessels as order principle to restore tissue architecture in liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 10371-10376 (2010).
2. Albenberg, L. et al. Correlation between intraluminal oxygen gradient and radial partitioning of intestinal microbiota. Gastroenterology 147, 1055-1063 e1058 (2014).
3. Ben-Moshe, S. & Itzkovitz, S. Spatial heterogeneity in the mammalian liver. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 16, 395-410 (2019).
4. Burgess. et al. Spatial transcriptomics coming of age. Nature Genetics Reviews (2019).
5. Hildebrandt, F. et al. Spatial Transcriptomics to define transcriptional patterns of zonation and structural components in the mouse liver. Nat Commun 12, 7046 (2021).
6. Sun, T. et al. ZNRF3 and RNF43 cooperate to safeguard metabolic liver zonation and hepatocyte proliferation. Cell Stem Cell (2021).
7. Parigi, S.M. et al. The spatial transcriptomic landscape of the healing mouse intestine following damage. Nat Commun 13, 828 (2022).
8. Chen, A. et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball patterned arrays. Biorxiv (2022)
9. Gao, S. et al. Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics. Cell Res (2021).
10. Guilliams, M. et al. Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily conserved hepatic macrophage niches. Cell (2022).