【原】PCR 作为猪的诊断工具 ：2、结果解释

如何解释阴性或阳性PCR结果，并结合可能发生的事情进行示例。

一、PCR检测的用途：

• 1、检测靶向病原体的DNA / RNA的存在 - 最常见的用途

• 2、通过靶向已知在血清型之间变化的特定基因（DNA/RNA）对病原体进行血清型分型

• ‍3、检测毒力基因的存在（例如，大肠杆菌基因分型）

重要的是，PCR检测仅检测基于引物的靶向遗传物质的存在，并不指示生物体是否可能具有传染性。 

（专业内容可不看）近年来，实验室开发了多重PCR，以同时检测多种病原体，或同一病原体的多种菌株或基因。这些多重PCR是同时运行的多个PCR。它们的成本高于单个PCR，但比单独运行PCR便宜得多，因为实验室在设备使用，实验室人员和试剂使用方面可以节省大量成本。该实验室将使用不同的标记来帮助确定哪些阳性结果属于哪些引物。通常，这些多重PCR是有意义的，例如测试大肠杆菌基因分型，其中可以同时在同一细菌分离物上评估大约14个基因。另一个例子是同时测试 PRRS  1 型和2型 。另一种常见的检测方案是同时检测猪流行性腹泻和猪冠状病毒。重要的是要注意，实验室需要确保不同PCR测定之间没有干扰。也就是说，循环温度和所使用的不同引物不会相互抑制或交叉反应。这些多重PCR中的每一种都必须在使用前进行验证，并且必须对测定进行显着优化。

二、解释结果时的注意事项：

PCR检测的挑战之一是，通常每个实验室都有不同的样品检测方案，其中可能包括DNA / RNA提取过程的差异，循环方案的差异以及所用引物的差异。这使得对从不同实验室获得的结果进行比较变得具有挑战性。

阴性

• 1、病原体样本、猪群确实呈阴性

• 2、确保为目标病原体提交了正确的样本。需要考虑的一些示例：

• 流感病毒不会全身性，因此不会在血液样本中发现。

• 猪肺炎支原体的口腔液体检测很少提供阳性结果，因为病原体通常附着在呼吸系统下部的纤毛上。

• 仅提交1个PRRS流产胎儿（只有50%的机会为阳性），应提交至少4个胎儿，以最大限1、度地提高找到阳性样本的机会

• 3、在疾病中采集得太晚的样本，病原体不再存在。

• 流感病毒仅存在于鼻腔分泌物中，仅持续 3-4 天

• 4、引物不匹配

• 新的 PRRS 菌株

• 5、畜群患病率低，样本动物未感染

• 需要大幅增加动物采样数量

• 6、由于合并样本而稀释弱阳性样品

• 合并已经稀释的样品的口腔液（测试多头猪，并且在阳性样本中已经预期具有高Ct值）

阳性

• 1、病原体样本、猪群真正阳性

• 2、无法区分样本是传染性还是非传染性

• 3、根据靶向病原体，DNA/RNA检测并不总是确认疾病

• 了解所用疫苗的时间和类型至关重要

• 可能需要测序

• 猪肺炎支原体的 PCR 肺组织阳性可证实组织中存在病原体，但不能确认病原体的严重程度或临床意义。在大多数猪群中（不包括支原体阴性群）需要目视确认肺损伤的百分比（粗略评估）以确定发现的临床意义。

• 猪圆环病毒 2 型 （PCV2） PCR 检测呈阳性的血清可确认 PCV2 的存在，但不能确认消瘦或肺炎是否可归因于 PCV2 或疫苗失败。需要对肺和/或淋巴组织进行免疫组织病理学检查，以证明与PCV2相关的疾病。

• 检测可能无法区分疫苗病毒/细菌与改良活疫苗和野毒感染。

• 4、如果样品处理不当，则会发生交叉污染

• 在进行样本合并时尤其如此。并样应在实验室罩下进行。

• 从地板上收集的粪便样本可能被病原体的环境残留物交叉污染

• 5、低 Ct 值与样本中的高病毒/细菌浓度相关，并且通常与临床疾病相关的可能性较高相关

• Ct < 20 → 猪增殖性肠病

• ct > 30 → 未检测到肠道病变

• 粪便中纤维素细胞内低 Ct 值更可能与肠道病变相关。

三、基因分型

• PCR基因分型的使用正变得越来越普遍，特别是对于大肠杆菌。它提供了有关影响猪群的分离株变化的流行病学信息（例如，H1N1流感与H3N2流感）。

• 通常使用基因分型结果来帮助选择要使用的疫苗，例如大肠杆菌。

• 重要的是要记住，结果仅代表单个分离株，通常猪会同时感染了多个分离株。

• 检测仅确认毒力基因的存在，但不确认其表达。通常，仅仅知道它具有表达基因的遗传潜力就足够了。

• 随着基因测序的成本和易用性的不断降低，PCR基因分型的使用或需求将会减少。