【原】【细胞治疗】——高分文献与应用多维分析

引言

肿瘤发病率和死亡率持续增高造成了严重的社会负担，驱动着肿瘤治疗的重要手段之一的CAR-T，TCR-T等细胞治疗技术的发展。
细胞治疗是利用来自患者或供体的活细胞来代替受损或患病的细胞，或刺激身体的免疫反应或再生的治疗，通常使用的是干细胞与免疫细胞。
本期将分别从基因、蛋白、细胞、组织四个层面展开，对细胞治疗领域前沿技术与文献进行解析和分享。

#1 基因层面

单细胞测序技术在细胞治疗中的应用
01 干细胞治疗
通过干细胞分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的一致实现对临床疾病的治疗。
干细胞种类多，按发育潜能和阶段可以分为不同类型。不同条件会诱导出不同类型、不同干性的干细胞；通过单细胞测序技术，分析细胞转录及蛋白特征，可以准确了解干细胞的表型，也可联合临床结果做关联性分析。

· 样本类型：健康人&AML（急性髓系白血病）患者骨髓
· 前期准备：流式富集，将CD34阳性造血干细胞、CD34阴性细胞、CD3阳性T细胞混样测序
· 细胞分型：通过转录组+蛋白组学的研究，将骨髓内的干细胞分为了56个亚群

·Focus在CD34阳性的造血干细胞
进行以下分析：

1. 拟时序分析HSC发育状态。

2.通过Abseq定义新的HSC发育Marker。

3.通过对HSC的Abseq结果进行算法分析，最终用12个Marker高精确度地鉴定14个CD34阳性亚群。

单细胞测序的优势特点在于，通量更高，可达上万个基因的维度分析。

02 CAR-T细胞治疗
 CAR-T细胞治疗工作流程

单细胞测序技术应用节点：
研发质控阶段——分析T细胞发生了哪些变化，细胞状态、克隆型、生物学特征、临床关联等。

（1）在CAR-T治疗临床前应用

（2）在CAR-T临床研究中的应用

单细胞测序优势：
在传统技术上进行更加透彻的分析：大细胞通量的条件下，进行全基因组+蛋白组，高纬度地分析每一个单细胞特征，包括：基因表达、富集功能、特异性Marker、聚类分群、异质性等。

03 TIL、TCR治疗
（1）TIL治疗机制研究

通过单细胞RNA测序发现，联合过继性疗法IL8R1+cluster细胞比例更高：IL8R1+cluster中高表达IL7R。

（2）肿瘤特异性TCR研究

（间接研究antigen-TCR）

发现黑色素瘤抗原特异性CD4+T亚群，并研究其phenotype及功能。

（直接研究antigen-TCR）
抗原特异性CD8+T细胞表型分析
CD8+T细胞：抗原-TCR paire分析

全基因组光学图谱技术（OMG）在细胞治疗中的应用
01 文献解析
AML和MDS患者中，DEK-NUP214融合是重现性的异常，预后不良。该融合在髓系血液肿瘤中比例较低（~0.7-2%）.传统核型G显带不容易检出t(6;9),尤其是低分辨率的骨髓染色体。加拿大大学健康医学联盟在今年2月报道了AML患者中t(6;14;9)三重易位，据了解，这是全球首次通过细胞遗传学检出的AML患者中t(6;14;9)三重易位。

t(6;9)的其他易位形式报道案例较少，2例涉及DEK-NUP214融合事件被报道。一例是核型检出t（1;9）, 转录组检出DEK-NUP214融合。另一例是细胞遗传学检出t(9;12)(q34;q15)且隐匿性插入在6号染色体上，也是通过RNA seq检出DEK-NUP214融合。由于6p和9q远端片段交换或隐匿性插入较难观察到，导致难以确定是否存在DEK-NUP214融合。将高分辨率SV检测技术OGM纳入常规临床检测有助于检出罕见的隐匿性的细胞遗传学异常。

该患者为一位32岁男性，图（A）核型G显带初始检测结果为18个细胞add(6)(p21),add(9)(q34),add(14)(q22)，2个细胞核型正常。基于核型结果6号和9号染色体易位断裂点位于DEK和NUP214基因所在的区带，序贯进行DEK和NUP214的FISH探针检测，图（B）显示在衍生6号染色体上观察到DEK和NUP214融合信号，随后依据FISH验证结果将核型结果修正为t(6;14;9)(p22;q22;q34).

随后进行了OGM检测，circos plot圈图（C）显示断裂点该患者样本检出位于6p22.3,9q34.12,14q22.1的三重易位，且线形图（D）显示DEK-NUP214融合基因。DEK-NUP214融合基因预后不良，该患者经诱导治疗，巩固治疗后接受了同种异基因造血干细胞移植。

OGM可一次实验检出和明确涉及DEK-NUP214融合的t(6;14;9)三重易位，该团队建议将OGM纳入临床实验室常规检测流程，用于检出白血病中与预后和治疗相关的异常。

  · Bionano Saphyr系统以100kbp-Mbp级别读长可实现超高灵敏度的结构变异检测分析和复杂基因组de novo组装。

在结构变异检测领域目前广泛应用于肿瘤、白血病、遗传病、罕见病等疾病的研究。相比传统的结构变异检测工具，如核型、FISH，Saphyr 拥有无可比拟的分辨率、全基因组覆盖度，便捷的操作流程以及直观的结果呈现，对结构变异领域的难点平衡易位和倒位，可准确检出。在基因组de novo组装领域，Saphyr 帮助生物学家极大提高scaffold，提升组装质量和完整性。

Saphyr 半导体芯片上有多达120,000个纳米通道，经高清CCD对所有纳米通道的DNA实时成像，每个flowcell可采集高达5T数据，软件自动将图片数据转换成分子数据，最终组装得到全基因组光学图谱。

#2 蛋白层面

MSD第三代电化学发光分析技术在细胞治疗中的应用
01 应用总览

  · 在接受CAR-T细胞治疗前，评估病人免疫状况，（Cytokinesis，CRP，Inflammation）。
  · 评估细胞因子状况，是否被激活，有效性（IFN-γ）。
  · 监测免疫系统的状态
  · 监控免疫进程，免疫有效性，副反应发生，评估免疫原性，毒性。

免疫治疗相关热门靶点：CTLA-4,Granzyme A,Granzyme B,LAG3,vWF，PD1，PDL-2，推荐使用MSD R-plex试剂盒进行开发验证实验，目前可以提供超过260种抗体对可供选择，应用涵盖：癌症、免疫、心血管、神经、代谢、疫苗等。
     
02 应用案例
(1)同济医院采用MSD进行CAR-T细胞治疗临床效果的关联性分析

IL-8，IL1β，IFN-γ升高，代表患者感染，需采取不同的治疗方案

结论：使用CAR-T细胞治疗后，若患者发热，则可通过分析以上因子的分泌情况，区分患者感染与CRS

（2）Kite 制药，使用MSD监测CRS

发现使用MSD技术相较于Luminex更加简便，且有严格的Validation。

（3）纪念斯隆-凯特琳癌症中心

（4）eurofins欧陆集团

(5)中检院
《CAR-T细胞治疗产品质控研究要点》建议采用MSD方法进行药效学检测、免疫毒性检测。

（6）诺华制药：
上市的细胞治疗药物免疫原性评价时，使用MSD进行检测
 
（7）Juno在细胞治疗研发阶段使用到MSD
采用基因编辑的方法，敲除PD1，进行免疫水平评估，探究是否能够提高CAR-T细胞治疗效果。结果表明：CAR-T细胞免疫原性明显增强。
 
  (8)使用CAR-T成功治愈患者的学者Carl H.June，以及肿瘤免疫治疗先驱Steven A Rosenberg也采用MSD方法进行细胞免疫学研究。

03 MSD在CRS（细胞因子风暴）监测应用的优势特点
 CRS监测需借助灵敏度高、动态范围广、有严格法规验证的平台。这凸显了MSD技术的极大优势：

（1）4-5 log超宽检测范围，fg/ml的检测极限，多个产品类型选择

（2）经过严格的Validation的V-plex试剂盒

  · CRS监测应用案例
Kite ，NCI，Juno等使用MSD试剂盒监测CAR-T细胞治疗的细胞因子风暴

  · 免疫原性金标准
获FDA，EMEA等法规推荐，经过大量临床实验使用和CRO验证，符合GLP要求。

MSD技术流程概览

#3 细胞层面

Lonza核电转仪在细胞治疗中的应用

自体T细胞免疫疗法其中一个关键痛点是GMP病毒载体（慢病毒和γ-逆转录病毒）的安全性、漫长的生产周期和高额的费用。

 解决这个问题的一个办法是利用非病毒转染方法对细胞进行基因修饰。该研究和开发进展迅速，但关键瓶颈在于扩大制造规模以满足商业需求。

Lonza的4D-Nucleofector™LV 单元采用电穿孔技术，可实现自动化、可扩展多种细胞类型和应用的非病毒转染方案。

以新鲜/冷冻的PBMC作为起始，4D-Nucleofector ™转染后，转入平台，第10天收获最终的T细胞产物。

如图所示，在电转后：

第0天-完成电转的PBMC静置4小时恢复，用含有IL-2和TransAct的X-VIVO培养基进行80%换液。
第1天–进行50%的培养基交换（276ml容量）。
第3天–进行80%的培养基交换（450ml容量），并移除TransAct。
第4天到第9天-进行75%的培养基交换（450ml容量）。
第10天-收集扩增的T细胞。

在第0、1、4、7和10天取样分析。

#4 组织层面

HALO数字病理图像全景分析技术在细胞治疗中的应用

肿瘤微环境中免疫细胞的特征及其对肿瘤治疗和预后的潜在影响是近年来研究的热点。在组织空间程度上分辨基因表达已成为了解组织内复杂多细胞相互作用的关键技术。RNA和蛋白质的分析为理解表达调控提供了宝贵的信息，能够在空间的角度对蛋白质和基因的表达水平进行分析。为了探索组织内细胞复杂的相互作用，ISH-IHC的相互结合为在同一组织样本上观察多个RNA和蛋白质的表达提供了可能。

通过策略性地选择ISH和IHC/IF标记，RNAscope可以针对分泌蛋白(如细胞因子或趋化因子)的转录本，而IHC/IF可以针对细胞标记，以识别分泌蛋白的细胞来源。

免疫细胞浸润到肿瘤，其激活状态和检查点表达模式均可通过双重ISH-IHC/IF法进行检测，其中ISH检测激活标志物，IHC/IF法检测CD3、CD4、CD8、CD68、CD45等免疫细胞标志物。

此外，用户还可以根据IF和探针的阳性率来定义细胞表型。

KFBIO江丰数字化病理扫描仪

01 设备推荐
  · 高通量持续加载扫描系统KF-PRO-400

  · 明场&荧光一体扫描系统KF-PRO-EX

02 产品特点
  · 高速扫描——线扫描技术
  · 高速稳定运动——直线磁轴电机
  · 自适应的扫描方式
  · 荧光机型——KF-FL系列（科研级SCMOS荧光相机）
  · 专业分析软件