【原】【LorMe周刊】原生动物“肠道”内的霍乱弧菌水平基因转移增强

LorMe青年 2022-08-02 发布于江苏

展开全文

作者：刘宸，南京农业大学博士在读，主要研究基于原生生物的土壤青枯菌生物障碍消减。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍霍乱弧菌被原生生物捕食后，在原生生物的肠道（吞噬泡）里存活，由于吞噬泡内环境改变，引发了霍乱弧菌SOS应答，进而提高了霍乱弧菌整合酶活性，原文于2022年发表在《The ISME Journal》。

导读

霍乱弧菌 (Vibrio cholerae) 是造成霍乱的病原菌，这类病原菌在霍乱爆发之间藏匿于水体环境中。在水体中，霍乱弧菌通常形成生物膜并附着在几丁质结构（例如甲壳纲动物的几丁质硬壳）表面。现有的研究表明几丁质可促进霍乱弧菌进行水平基因转移（Lateral Gene Transfer， LGT）。一方面，几丁质可以调控霍乱弧菌VI型分泌系统（T6SS），裂解邻近细胞从而释放后者体内DNA，另一方面，几丁质可以诱导霍乱弧菌进入自然感受态（Natural Competence），捕获这些DNA片段。这些DNA片段上的基因随后需要整合到霍乱弧菌的基因组中进行表达并最终传递给子代V. cholerae。这一整合过程可能需要可移动基因元件（Mobile Genetic Elements ，MGEs）的参与，特别是针对通过RecA调控的同源重组难以整合到基因组中的DNA片段。霍乱弧菌基因组中的整合子是具有位点特异性的MGEs，可以将捕获的被称为基因盒（Gene Cassettes）的DNA片段整合到细菌基因组。整合子行使其功能依赖于其所具有的整合酶，后者的活性通常被细菌的SOS应答所激活。

在自然条件下，霍乱弧菌同时也是一些原生生物的“猎物”。原生生物如阿米巴在捕食细菌时，会通过吞噬作用将细菌包裹在吞噬泡（Food vacuoles或者Phagosome）中然后进行吞食，随后吞噬泡会在原生动物体内和溶酶体融合形成吞噬溶酶体，对其内的细菌进行“消化”。本研究以编码V. cholerae整合酶的基因 IntIA作为研究对象，研究了原生动物的捕食对霍乱弧菌LGT的影响。

主要结果

一、霍乱弧菌的整合酶在原生动物吞噬泡中被诱导

为了探究霍乱弧菌被原生动物中捕食后，其内的整合酶是否被诱导表达，研究者首先构建了整合酶基因intIA和gfp的融合基因表达载体，并通过几丁质诱导霍乱弧菌A1552进入感受态，最终构建了霍乱弧菌整合子-整合酶荧光报告菌株。

在经过4小时的共培养后，可以在梨型四膜虫和棘阿米巴这两种原生生物的吞噬泡中观测到具有绿色荧光信号的霍乱弧菌（Fig.1）。此外，在棘阿米巴所形成的包囊中，同样也观察到了具有绿色荧光信号的霍乱弧菌（Fig.1B，粉色箭头）。随后使用Triton-X裂解原生生物细胞，释放其内霍乱弧菌，利用荧光分光光度计量化霍乱弧菌荧光信号强度，同时使用qRT-PCR量化霍乱弧菌intIA基因表达。结果表明，与梨型四膜虫和棘阿米巴共培养的霍乱弧菌，其内的绿色荧光信号的强度分别是无原生生物捕食压力下的53和15倍（Fig.2）， intIA表达则分别是29和4.8倍（Fig.3）。

Fig 1：霍乱弧菌和原生动物梨型四膜虫（Tetrahymena pyriformis）（A）和棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）（B）共培养的显微成像。

intIA::gfp表示霍乱弧菌的整合子-整合酶荧光报告菌株， intIA::gfp,ΔrecA表示去除recA基因的报告菌株，+QT代表在体系中添加100 mM硫脲。图中绿色、红色和蓝色荧光区域分表整合酶表达区域、膜结构以及原生动物细胞核。粉色箭头指向物体为阿米巴虫包囊，黄色箭头指向吞噬泡。

Fig 2：从原生动物体内释放的霍乱弧菌GFP荧光强度。

intIA::gfp,ΔrecA/pSU::recA和intIA::gfp,ΔrecA/ pSU表示intIA::gfp,ΔrecA的回补株和空质粒对照。Tp表示梨型四膜虫， Ac表示棘阿米巴。

Fig 3：从原生动物体内释放的霍乱弧菌intIA基因表达的qRT-PCR定量

二、原生生物胞内霍乱弧菌表现出更高的基因盒转化频率同时霍乱弧菌对于邻近细胞内DNA的转化依赖于T6SS

为了确定原生生物的捕食是否提高了霍乱弧菌对于基因盒转化效率，研究人员构建了基因盒pKC01，在共培养体系中加入5 μg的pKC01作为游离DNA，同时单独培养霍乱弧菌作为对照。在共培养体系实验和对照中，只有预先使用几丁质培养过的霍乱弧菌可以产生pKC01的转化子。与梨型四膜虫和棘阿米巴共培养的霍乱弧菌对于pKC01的转化效率，分别是无原生生物捕食压力下的405和18倍（Fig.4A,B）。

由于游离DNA同样可以诱导细菌体内RecA基因的表达，随后通过RecA调控的同源重组整合到基因组中，因此研究人员构通过添加pCVD442::Δrtx这种只能通过同源重组才可以整合到细菌基因组的质粒，研究共培养对于同源重组的影响。结果发现，霍乱弧菌对于pCVD442::Δrtx的转化并没有在原生生物捕食压力下得到提高（Fig.4A,B，灰色标记区域），且和在无原生生物胁迫下对pKC01的转化具有类似的转化效率。这表明，原生生物胁迫下pKC01转化效率的提高是源自整合酶基因的上调表达而不是源自同源重组的增强。

为了验证原生生物捕食胁迫是否同样提升霍乱弧菌对邻近细胞所包含的pKC01的转化效率，携带pKC01的E. coli WM3064作为pKC01的供体被加入到培养体系中，结果发现，预生长在几丁质上的霍乱弧菌，可以吸收并整合源自E. coli WM3064的pKC01，在梨型四膜虫以及棘阿米巴存在的条件下，转化效率分别为7.73×10⁻⁵和 2.06×10⁻⁵（Fig.4C,D）。

值得关注的是，T6SS缺陷型霍乱弧菌（Δhcp1,2）无法转化E. coli WM3064中的pKC01，这表明，对于邻近细菌胞内DNA的转化依赖于霍乱弧菌的T6SS。

Fig 4：与梨型四膜虫（Tp）以及棘阿米巴（Ac）共培养后，霍乱弧菌的转化频率。

人工构建的基因盒pKC01 和自杀性质粒pCVD442::Δrtx（灰色标记区域）分别以游离DNA（A和B）亦或者被大肠杆菌E. coli WM3064携带的（C和D）形式加入到共培养体系中。

三、霍乱弧菌在原生生物体内intIA转录以及进行基因盒转化依赖于SOS应答

以往的研究发现，整合酶基因intIA的表达受到细菌SOS应答途径的调控。 SOS应答途径是细菌应对DNA损伤的修复机制，所参与的蛋白包括 RecA 蛋白。RecA 蛋白受单链DNA刺激，参与SOS反应基因阻遏蛋白 (LexA) 的失活，从而诱导SOS应答。

研究发现，SOS应答缺陷型菌株ΔrecA，在和梨型四膜虫共培养时，感测不到荧光信号（Fig.1A）以及intIA 表达（Fig.2A）。与之类似的，在和棘阿米巴共培养后，在ΔrecA中仅观测到极低荧光信号（Fig.1B），其intIA表达仅为荧光报告菌株的十分之一（Fig.2B）。转化实验表明，ΔrecA在对照和原生生物胁迫下，都无法产生pKC01转化子（Fig.4）。随后通过recA的回补，则在各种实验中恢复了intIA的表达以及对pKC01的转化。

由于pKC01需要首先通过RecA环化，随后方可进入霍乱弧菌胞内进而被整合，所以为了确定在转化实验中ΔrecA无法进行pKC01的转化是由于SOS应答缺陷而不是由于pKC01无法环化，研究人员构建了霍乱弧菌的lexA(ind-) 突变体，这类突变体中的LexA对RecA具有较强的抵抗能力，同样是SOS应答缺陷型菌株。lexA(ind-) 同样无法在转化实验中观测到pKC01转化子的产生，证实了SOS应答是原生生物捕食胁迫下霍乱弧菌对外源DNA转化所必需的。

Fig 5：使用荧光染料DCF-DA量化原生动物体内氧化自由基的产生

四、霍乱弧菌内intIA的表达和水平基因转移需要原生生物产生的氧化自由基

原生生物通过吞噬泡捕获细菌后，会在吞噬泡产生氧化自由基。因此研究人员推测，可能是由于吞噬泡内氧化自由基的产生激活霍乱弧菌的SOS应答，并随后诱导intIA的表达。在共培养体系中添加硫脲（thiourea）以清除体系中可能产生的氧化自由基，结果发现硫脲清除了2/3原生生物产生的氧化自由基（Fig.5）。在共培养实验中，硫脲的添加可以分别降低梨型四膜虫和棘阿米巴虫胞内霍乱弧菌GFP荧光信号7.4和2.3倍（Fig.2）。RT-qPCR同样证实了这一现象，与未添加硫脲培养的霍乱弧菌相比，霍乱弧菌在梨型四膜虫和棘阿米巴虫胁迫下，intIA 表达分别降低了1.8和1.6倍（Fig.3）。在pKC01作为游离DNA的转化实验中，降低的倍数分别为535和47倍，在E. coli WM3064转化实验中，降低的倍数分别为389和45倍（Fig.4）。同时，对于无原生生物捕食压力的对照中，硫脲对于转化效率并无影响，这也表示pKC01转化效率的提高是由于吞噬泡内氧化自由基的产生（Fig.4）。

结论

本研究首次观测到细菌整合酶在原生生物吞噬泡内被诱导表达，且这种诱导表达是由于原生生物生产的超氧自由基。此外，研究表明霍乱弧菌在原生动物的捕食压力下可以通过VI型分泌系统获取邻近细菌体内的DNA。这些结果表明，原生生物的捕食胁迫可以促进霍乱弧菌的水平基因转移，进而产生遗传变异，潜在地增强了霍乱弧菌在原生生物捕食下的存活能力。此外，原生生物捕食会将多种细菌捕获在捕食泡内，这使得捕食泡成了细菌水平基因转移的“热点”区域，同时由于捕食泡内微环境的改变导致细菌SOS响应机制的激活，进而促进遗传的多样化和演化。